精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系.doc

精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系
作者：曹晓敏 苏园园 何茜冬 郑轶群 林仲秋
【摘要】 目的：探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系。方法：收集分析70例不育不孕患者共88个IUI治疗周期，精子染色质扩散(SCD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，并按妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组，比较各组间精子DNA碎片比值、精子核成熟度和IUI妊娠率的关系。结果：非妊娠组SCD小光晕和无光晕精子(精子DNA碎片) 比值平均为(28.3±10.6) % , 非妊娠组明显高于对照组(12. 0 ±5. 9)%( P<0. 05);而大光晕和中光晕精子比值非妊娠组明显低于对照组(P<0. 05) ; 非妊娠组组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组。结论：非妊娠组患者核成熟度异常的精子、精子DNA碎片比例增高。
【关键词】 复发性流产; 精子; DNA损伤
宫腔内人工授精(intrauterine insemination, IUI)是将洗涤处理过的精子悬液通过导管直接注入子宫腔内，使精卵自然结合达到妊娠生育目的的一种辅助生育技术，其适用人群广泛。影响IUI成功的因素诸多，目前尚无定论。大部分研究主要集中在女方年龄、不孕的年限、授精时机及次数、用药方案、局部盆腔结构、子宫内膜厚度、输卵管壶腹部的直径、输卵管伞端距宫角的距离、精子质量与IUI妊娠率的关系[1～3]。关于精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常规精液分析水平上进行。其提供的信息不能很好评估精子的质量。在预测妊娠结局方面的价值十分有限。本课题拟通过对精子DNA完整性、精子核成熟度的检测来分析精子质量与IUI妊娠率的关系[4]，本研究对2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗的70例男方精液进行分析，精子染色质扩散(SCD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，探讨上述指标与IUI妊娠率的关系。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗患者70例共88个周期，治疗前需证实女方至少有一条输卵管通畅及无排卵功能障碍，并排除盆腔炎症和女性生殖内分泌异常等潜在的不孕因素的影响。我们将88个IUI周期根据妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组。
　　1.2 主要试剂与仪器
　　ISAS精子分析系统(西班牙);NIKON E1000 荧光显微镜(日本);NIKON E200 普通光学显微镜(日本)。主要试剂：低熔点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇(DTT)、联咪二苯吲哚(DAPI)，均购自美国 Sigma 公司。
　　1.3 标本采集
　　受检者应禁欲3～7d，用手淫或体外排精法收集精子，标明采集的时间，置37℃平板上液化后进行检测。
　　1.4 SCD 实验
　　根据文献[5，6]，精液标本处理：精液标本用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至10×106/ml 1000 rpm10min， 弃精浆， 精子沉渣用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至1×106～10×106/ml，取0.3ml 处理好的精液与0.7 ml 1%低熔点琼脂凝胶混匀，37℃ 孵育;吸取50ul 上述精子混合液滴在经过0.65 % 正常熔点琼脂预处理过的载玻片上，盖上22mm×22mm 盖玻片4℃放置5min。精子变性及裂解：小心去除盖玻片，室温(22℃左右)将标本载玻片浸入0.08 mol/l 的盐酸(HCL)内变性7min;然后浸入精子裂解液内(pH 7.3)20min;再移入缓冲液中3min，脱水。将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。所有操作过程均要求载玻片(标本)处于水平状态。空气自然干燥后加入4′，6二脒基吲哚(DAPI)染色，荧光显微镜下观察结果。
　　1.5 精子核蛋白组型检测
　　精液液化并记数，洗涤调整精子密度至40×106/ml，取精液1ml，1000g离心3min，去上清液，重复3次，去除精浆加入1ml粘合液，取5ul涂片，空气干燥，加固定液固定90s，冲洗玻片，脱色、封片。镜检:涂片经苯胺蓝染色后，显微镜下高含赖氨酸的精子核呈蓝色，颜色分布基本均匀，一般在精子核后半部分着色较深，顶体部分蓝色较浅，大部分精子不显色显蓝色的为阳性，不显色的为阴性，每个标本计数200个精子。
　　2 统计学处理
　　数据输入计算机SPSS(12.0 版)软件，经t 检验进行统计处理。P<0.05 认为有统计学差异。
3 结果
　　3.1 DNA完整性检测结果
　　SCD实验普通光学显微镜图片见图1。计数500个精子，观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4 个等级，大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。小光晕以精子头直径≤1/4为判断标准;中光晕精子头直径>1/4，而精子头直径≤2/3;大光晕精子头直径>2/3。精子SCD实验显示大、中、小光晕和无光晕精子的比例，见表1。非妊娠组患者SCD小光晕和无光晕精子比值平均为28.3 ±10.6%，对照组(12. 0 ±5.9) %，两组比较差异有统计学意义(P<0. 05)。大光晕和中光晕精子比值在IUI妊娠组和对照组分别为(72. 6 ±5. 3)%和(60.7±12.5)%，两组比较差异有统计学意义(P<0. 05)。A为妊娠组：1～2为大光晕的精子，A3～5为中光晕的精子B为非妊娠组：1～2为小光晕的精子，B3～5为无光晕的精子图1 SCD实验检测两组精子DNA碎片结果表1 两组SCD大、中、小光晕和无光晕精子的比例
　　3.2 精子核蛋白组型检测
　　对两组70例标本进行苯胺蓝染色，非妊娠组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(P<0. 05)，见表2。表2 两组苯胺兰染色阳性率平均值比较
　　4 讨论
　　目前关于女方因素对IUI妊娠率影响的研究比较深入并形成一些共识。而精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常规精液分析水平上进行。虽然常规精液分析为我们了解精液质量提供了一些重要信息,然而这些信息不能完全评估男性的生育能力，临床上约有15%的男性不育患者精液常规检查是正常的，所以常规的精液分析对评价精子的质量存在缺陷和不完善之处，对预测妊娠结局方面的价值十分有限。因此我们需要寻找新的、敏感的评估精液质量的指标，深入分析IUI失败的原因，以便帮助临床医生进行诊断和制定治疗方案，是当前急需解决的问题。本课题通过对两实验组患者精子DNA碎片和精子核成熟度的检测，发现非妊娠组患者精子DNA碎片比例增高。精子DNA损伤常常是多个因素作用的结果,但其确切机制现在还不清楚,一般认为有如下3种：①凋亡;②异常氧化应激;③精子染色质组装缺陷。在精子形成过程中,正常情况下,赖氨酸丰富型组蛋白被鱼精蛋白替代,这是随后发生去凝缩作用形成精原细胞的必要条件。精子核成熟度直接影响精子的受精能力和受精后原核的形成及胚胎的发育[7]。精核蛋白分子中一般不含赖氨酸,而组蛋白和过渡蛋白中则有众多赖氨酸。本研究利用苯胺蓝可与富含赖氨酸的蛋白结合,呈蓝色,检测精子精子核的成熟度。我们发现非妊娠组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组，说明非妊娠组可能是由于精子核成熟度异常，精子核蛋白转换障，导致DNA不稳定及受损，妊娠失败。据此可以对就诊的不孕夫妇进行合理的筛查，使那些质量不佳通过IUI受孕机会较小的病例，直接求助疗效更为可靠的其他辅助生殖技术，就可以避免不必要的IUI治疗对患者身体、精神和经济上的损害。再次对精子质量好适应于IUI治疗的患者，我们建议至少应进行 3～4 次 IUI 治疗周期，避免使用体外受精-胚胎移植(IVFET)和单精子显微注射(ICSI)等技术难度更大、费用更高、侵袭性强的其他辅助生殖技术。另外通过本研究对IVF前的常规精液分析结果正常但反复IVF失败的患者继续治疗提供方向和理论指导。但是关于精子核成熟异常与DNA受损与妊娠失败发生的机制、响因素及其治疗，还需大量深入详细的研究。
【参考文献】
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