多环芳烃降解菌的研究--文献综述.doc

毕业论文文献综述
多环芳烃降解菌的研究
摘要:多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PAHs)是广泛存在于环境中的一类持久性有机污染物，具有致癌、致突变特征，是由2个或2个以上苯环以线状、角状或簇状排列组成的芳香族化合物。PAHs水溶性差、辛醇鄄水分配系数高，稳定性强，容易吸附在土壤表面，对人类健康和生态环境具有极大的危害，已经引起了各国环境学家的重视。生物修复技术(bioremediation)是目前最具有潜力的PAHs污染土壤修复技术，其中微生物降解是去除环境中多环芳烃最主要的途径，迄今已分离到多种PAHs降解菌，目前该领域研究存在的主要问题是PAHs降解优良菌的筛选、鉴定以及降解特性的深化研究。
关键词：多环芳烃；有机污染物；微生物降解；降解菌筛选

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是指由两个或两个以上苯环，以直链状、角状或串状排列组成的化合物，是环境中普遍存在的持久性有毒有机污染物[1]。大量研究证实，多环芳烃具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，引起各国环境科学工作者的广泛关注[2]。美国环境署在1979年将16种PAHs列入环境污染物优先监测的黑名单，中国政府列出的环境监测优先污染物中也包括了7种PAHs，所以找到能有效降解PAHs的方法是重要的环保课题，而微生物降解是当前学术界普遍认为去除PAHs的最主要途径[3]。
目前，治理PAHs污染土壤的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复[4]。物理化学修复具有成本昂贵、容易造成生态环境破坏的缺点，不适合大规模应用；生物修复技术（包括微生物修复和植物修复）因具有成本低、无二次污染、可大面积应用等独特优点而越来越受到人们的重视；微生物-植物联合修复，将微生物修复与植物修复的优点相结合，利用自然环境中植物根系对微生物生长的促进作用，有效地提高PAHs微生物降解率，所以植物与微生物二者的联合作用对的降解研究已成为近年来新的研究热点之一。
本文根据国际上最新的研究报道，就多环芳烃污染、多环芳烃污染的微生物修复、多环芳烃降解菌筛选、多环芳烃降解菌鉴定等方面作一简要综述。
1、土壤多环芳烃污染
土壤是一个十分复杂的多相体系和动态的开放体系，其固相中所含的大量粘土矿物、有机质和金属氧化物等能吸持进入其内部的各种污染物。当进入土壤的超过它们的降解能力时，产生显著积累，当累积量超过土壤自身的承受能力和允许容量时，就会造成土壤污染[5]。因此，土壤多环芳烃污染是指由于人类活动将多环芳烃加入到土壤中，致使土壤中多环芳烃含量明显高于其自然背景含量、并造成生态破坏和环境质量恶化的现象。
1.1土壤多环芳烃污染的来源
多环芳烃大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、汽油、重油、有机高分子化合物、纸张作物秸秆、烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的，其来源可分为天然和人为两种。
环境中多环芳烃的天然来源主要是陆地和水生生物的合成、森林和草原火灾、火山爆发等，在这些过程中均会产生PAHs。环境中多环芳烃的主要来源是人为源，人为源包括化学工业污染源、交通运输污染源、生活污染源和其他人为源,其中化石燃料的燃烧是环境PAHs的主要来源[6-7]。在工业发达国家，人为地燃料燃烧是土壤PAHs的主要来源[8]。因此，近100~150年来土壤PAHs的浓度在不断增加，尤其是城市地区。严重污染区PAHs的存在与下列工业行为有关：化石燃料的汽化和液化；利用化石燃料生产热和电焦炭生产；催化裂解；碳黑的生产和应用；煤焦油的生产和应用；原油及其衍生物的精练和分馏；木材的保护性处理和防腐剂生产；石油贮存、转运、处理与应用；废物倾倒和垃圾填埋；露天燃烧（垃圾、轮胎、塑料等）和焚化过程等[9]。
1.2土壤多环芳烃污染的危害
PAHs污染土壤、对环境具有危害性，是由于PAHs辛-醇水分配系数高，属于脂溶性物质，对生物有致癌、致畸、致突变作用，且在环境中稳定存在。16种PAHs优先监测物的一半以上都有致癌作用，其中苯并[a]芘的毒性最高，PAHs的生物毒性除苯并[a]芘的致癌性外，其它PAHs贡献了相当于苯并[a]芘等效致癌浓度毒性的103%~741%，PAHs本身没有毒，但当其通过食物链进入动物体内后会损伤生物血细胞DNA，引起血细胞DNA链断裂，改变遗传物质的编码信息；还会上调线粒体编码基因表达转录水平，提高相应的抗氧化酶活性表达，使得细胞活性氧分子量增加及细胞氧化损伤。随着经济的发展，我国几个主要经济区出现了不同程度的PAHs污染，有的区域污染已经很严重，如长江三角洲江苏无锡某乡镇土壤中PAHs总量为1058~9500μg/kg，主要为4-6环PAHs，三环以上占PAHs总量的87.0%～94.5%，其中四环就占到PAHs总量的47.9%～53.0% [10]，按照王国庆[11]等对土壤中苯并[a]芘的致癌临界浓度研究计算出农业用地临界浓度为282μg /kg和28μg /kg，可以得出无锡地区土壤中PAHs对人体有更大的致癌性。
2、 土壤PAHs污染的微生物修复
微生物具有氧化、还原、分离以及转移和变换元素周期表中的大部分元素的能力。所谓的微生物修复就是利用微生物的上述能力去除和解毒土壤、底泥沉积物和地下水中的污染物，从而使污染的土壤部分或完全恢复到原始状态。
2.1微生物降解多环芳烃的机理
多环芳烃的微生物降解难易度取决于化学结构的复杂性和降解酶的适应程度。不同的微生物对各类多环芳烃有不同的降解能力（降解速率、降解程度），所以降解多环芳烃的途径就有较大的差别。研究表明，微生物降解多环芳烃一般有两种方式[12]：一种是以多环芳烃为唯一碳源和能源；另一种是将多环芳烃与其他有机质进行共代谢。对于土壤中低分子量的三环和三环以下的多环芳烃类化合物，微生物一般采用第一种代谢方式；而大多数细菌对四环或四环以上的多环芳烃的矿化作用一般以共代谢方式开始，真菌对三环以上的多环芳烃的代谢也多属共代谢。
微生物降解PAHs的基本过程是：PAHs通过两种途径进入微生物(包括真菌和细菌)细胞中，一种是真菌氧化，真菌在其胞内酶细胞色素酶Cyt P-450作用下先将一个氧原子加到PAHs的C-C 键上形成C-O 键，然后再以同样的方式加入另外一个氧原子，从而生成芳烃氧化物，芳烃氧化物在非酶促结构重组中失去一个氧原子变成酚类，并在环氧化物水解酶作用下还原形成反-二醇；另一种是氧分子在细菌双加氧酶作用下同时将两个氧原子加到PAHs上，将PAHs氧化成芳烃过氧化物，在芳烃过氧化物上加H得到顺-二醇，两种过程产生的二羟基化合物-顺反二醇都代谢生成重要的中间产物邻苯二酚，接着经过脱水等作用而使C-C 键断裂、苯环断开，进一步代谢为柠檬酸循环的中间产物醛或酸，如琥珀酸、乙酸、丙酮酸和乙醛[13]。有氧氧化是PAHs降解的主要方式[14]，这些中间产物最终会在微生物细胞中被氧化分解为H2O和CO2 (图2-1)。

图2-1微生物氧化降解PAHs的过程[15]
Fig.2-1 Proposed pathway for the degradation of PAHs by microorganism
2.2土壤中能高效降解PAHs的微生物
许多细菌、真菌及藻类都具有降解以PAHs的能力。近年来分离到的PAHs降解菌主要包括芽袍杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacetirum)、诺卡氏菌属(Nocardia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)[16]和黄杆菌属(Flavobaterium)等细菌；真菌氧化芳香烃的能力是普遍的，在真菌中研究较多的是白腐真菌(White rot fungi)；尽管有些藻类能够降解PAHs，但由于其光能自养特性，降解能力较差，很难见到有关能够利用PAHs或耐PAHs藻类的研究报告。
一般来说，随着PAHs苯环数量的增加，其生物降解速率越来越低。许多微生物能以低分子量的PAHs(四环以内)作为唯一的碳源和能源，并将其完全矿化。然而，对于高分子量的PAHs，由于其化学结构的复杂性以及在水环境中的低溶解度，难以被微生物直接降解。研究表明，大多数细菌对四环以上的高分子量PAHs的降解是以共代谢(Cometabolism)的方式进行的；真菌对三环以上的以PAHs的代谢也属于共代谢[17]。
3. PAHs降解菌的筛选与鉴定
3.1 PAHs降解菌的筛选
微生物对有机污染物适应性的遗传机制研究表明，微生物为了在污染地区环境中生存，微生物之间可以发生水平基因转移或在微生物的染色体内进行基因重排、突变、复制，以形成能够降解有机污染物的优势菌，从而充分利用污染物作为其生长基质或形成共代谢。从长期受石油污染的土壤中分离、筛选出高效多环芳烃降解菌，是生物修复多环芳烃污染土壤的第一步，也是关键的一步，了解其生物学特胜及降解能力，是利用降解性微生物进行原位生物修复的必要理论基础。能够降解多环芳烃微生物包括真菌、细菌和放线菌。但许多真菌都是条件致病菌，许多丝状真菌会产生大量抱子，引起人、牲畜和其他植物的病害，造成二次污染，而放线菌生长缓慢，土壤中数量、总生物量远小于细菌。因此，分离筛选高效多环芳烃降解细菌并研究其生物学特性,是本研究的基础和条件。
传统的方法是利用平板技术直接分离PAHs降解菌[18]，这一方法由于其便于菌种分离的优点目前仍被广一泛使用。Basitaen等[19]利用锆-聚矾复合膜这一可吸附PAHs的载体来筛选具有PAHs粘着性的降解菌株，以期提高环境中那些被土壤或淤泥吸附的PAHs的降解效率。伍凤姬[20]以芘(pyrene)为多环芳烃生物降解研究的模型物，从农田土壤中筛选出能以芘为唯一碳源的降解菌株，并从中挑选出降解效果最好的菌株CP13，探究不同培养条件对该菌株降解芘的影响；采用蛋白质组学技术分析降解菌CP13在芘诱导下的蛋白表达差异；结合GC-MS对芘降解中间产物的检测结果，初步推导出CP13降解芘的途径。高闯等[21]从柴油污染土壤中筛选分离出一株萘降解菌N-3，进行菌种鉴定及萘双加氧酶基因（nah）验证，并考察该菌对不同种类多环芳烃（PAHs）的降解能力及降解过程中脱氢酶活性的变化。发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）含有nah基因；对液体培养基中质量浓度为50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h，计算出菌株N-3对萘、菲、蒽、芘、芴的降解率。该菌不仅能有效降解萘，且对其他种类PAHs也有一定降解作用。
随着分子生物学的迅猛发展，基于特定DNA片段或核糖体RNA的检测筛选技术已经逐渐成为一种选择[22-23]，其关键在于PAHs降解途径中重要降解酶的基因序列的测定，这些基因片段有可能成为环境中以PAHs降解菌的筛选探针。
3.2 PAHs降解菌的鉴定
PAHs降解菌的鉴定方法包括结合形态学、生理生化和分子生物学3方面对该菌株进行鉴定。通过电子显微镜观察菌体形态。分子生物学鉴定采用16S rDNA全长基因序列分析和构建系统发生树：平板划线得到降解菌单菌落，挑取单菌落进行PCR扩增。引物：上游引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和下游引物1492R (5′-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应条件为：94°C 5min；94°C 1min，55°C 1min，72°C 2min，35个循环；72°C 10min。根据常见细菌系统鉴定手册[24]对该菌株做进一步的生理生化鉴定。
唐婷婷[25]采用测定液体培养基中Abs法来确定微生物对三种多环芳烃的降解作用，所选用的微生物是从汽车尾气污染较严重的路边土壤中采集分离而来。通过以上将降解菌株的生理生化反应特性分析，并与伯杰氏细菌鉴定手册菌株特征比较之后，将所研究两种菌归为假单胞菌属中的荧光假单胞菌(Pseudomonas sp.)，且其中与荧光假单胞菌的生物I，生物II较为接近。降解菌株的生理生化特性见表3.1所示。
表3.1 降解菌株的生理生化特性
Table 3.1 The physiological and biological characterizations of the shtrains
项目
菌株
白色菌
黄色菌
甲基红
+
+
过氧化氢活性
+
+
蔗糖
+
+
葡萄糖
+
+
乳糖
-
-
尿素
+
+
柠檬酸盐
+
+
石蕊牛奶
-
-
淀粉水解
-
-
明胶液化
+
+
油脂水解
+
+
V.P试验
-
+
硫化氢实验
+
+
鉴定结果
假单胞菌属Pseudomonas sp.
假单胞菌属Pseudomonas sp.
注：“+”为阳性反应，“-为阴性反应
宋立超等[26]采用富集培养的方法，从PAHs污染盐碱化土壤中分离出一株能以菲、芘为唯一碳源和能源的优势菌TJB5。经形态观察和16S rDNA序列分析结果表明该菌株为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。采用液体培养的方法研究pH、盐度、菲芘的初始浓度对TJB5菌株降解菲芘效果的影响，确定最佳降解条件。结果表明：该菌对菲、芘的降解具有较广泛的pH、盐度范围和良好的降解效果。在菲、芘浓度分别为50 mg/L、pH 6.8−9.5、盐度2%−3%、温度30 ℃条件下，接种15 d后菲降解率在93.3%以上，芘降解率在20%以上。
通常污染土壤中并不是一种微生物在降解PAHs，因微生物种类不同，微生物细胞内所含酶系统有很多差别，而PAHs的降解过程涉及多种芳烃的降解，不同的阶段所需要的细菌种类可能有差别，所以PAHs的降解是不同微生物间的一种协同作用共同来完成这一工程[27]。

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