两栖类肢体再生和鱼类尾鳍再生过程的比较.docx

鱼类尾鳍再生和两栖类肢体再生过程的比较
曹逸涵
摘要：硬骨鱼的尾鳍和有尾两栖动物的肢体都具有完全形态再生能力，作为进化上同源的两种附属肢体，其再生机制也具有一定的保守性。本文将从再生原基细胞来源、位置信息的记忆与确定、再生相关基因及其表观遗传修饰等角度，分析两种再生过程的异与同，为认识肢体再生的保守机制及物种特有机制提供参考。
关键词：肢体再生 硬骨鱼 有尾两栖动物 形态重建 位置信息 表观遗传
肢体的再生是在部分硬骨鱼和有尾两栖类动物具有的特殊能力。当对斑马鱼的尾鳍进行截肢后，可重新形成尾部的简单组织，其再生干细胞可以重建原有尾鳍的形态，即侧视图中的M形结构。同样能够进行形态重建的典型系统是两栖类的肢体再生。当有尾两栖动物的前肢或后肢被截止后，可以再生出四趾的前肢和五趾的后肢。而当其前肢分别在腕部、肘部、上臂等不同部位截肢时，再生的肢体分别为端骨、结合骨和端骨，以及柱骨、结合骨和端骨。[1]
尾鳍作为硬骨鱼的附属肢体，与四肢动物的肢体具有进化同源性。鱼类尾鳍的再生与两栖动物肢体再生过程也具有一定的保守性。本文将选取两类能够进行完整肢体形态重建的生物——硬骨鱼和有尾两栖动物，讨论两者在肢体再生，特别是在完整形态重建方面的异同，为认识肢体再生的保守机制及物种特有机制提供参考。
保守性因素
再生原基细胞的来源
动物的肢体大都经历相同的过程，即（1）伤口愈合（2）伤口表皮的形成（3）形成具有分裂增殖能力的再生原基，以及（4）细胞的分化和肢体形态发生。其中再生原基的形成是关键性步骤，它由一些分化程度较低、具有多能性的间质细胞组成，并且保存有原来的位置信息。
目前普遍认为，鱼类和有尾两栖动物的再生原基均来自于细胞的去分化。在两栖动物中，它们来源于伤口附近的细胞；而在鱼类中，它们从截肢面近端的广泛区域被招募来。[2]这些细胞可能经历了与iPS细胞类似的分子机制，尽管它们的多能性还在争议中。3个iPS细胞的关键基因——Sox2、Klf4和c-myc被发现在蝾螈的再生肢体中上调表达。[3]在鱼类中，再生原基会表达的msx基因族，它们可能指导细胞的去分化。[2]另一些与获得多能性的基因也被发现表达，其中几个基因甚至是启动再生过程所必须的。[3]
位置信息的记忆
鱼类和有尾两栖动物的再生原基的细胞均能记忆截面处的位置信息。在蝾螈中，肢体再生符合经典的远端替代原则，即肢体细胞能够记忆自己所在处的位置信息，当截肢发生后，再生原基可以识别截面近端处的位置信息，重建远端的肢体结构。而在斑马鱼中，截肢的尾鳍能再生出原有的M形形状，显示尾鳍细胞也能储存位置信息。[1]这意味着，再生原基细胞应由之前经历过位置信息的细胞产生，并在分裂中继续保持。再生原基细胞虽然可能经历了与iPS细胞类似的过程，但不可能与高度去分化的iPS细胞完全相同。
调控信号
一系列在再生原基形成和生长过程中有潜在重要作用的基因被鉴定出，它们部分具有物种间保守性，包括TGFβ、activin、BMP、IGF、FGF、Wnt、MMP，以及胞外基质组分和凝血因子等。当阻断这些通路时，再生过程在早期阶段即被阻止。[4]研究显示，很多因子在不同的组织再生过程中普遍地被激活，这些组织和器官包括尾鳍、心脏、视网膜等。这种重叠性表明一些核心机制，如感知创伤、细胞周期调控以及形态发生程序的激活等，在不同的再生系统中具有共性。[2]
神经支配作用
再生原基需要神经支配进行增殖和生长。如果在截肢前将肢体基部的神经切断，再生原基将生长不良，再生过程被阻断。而若在再生原基形成后再切断神经，增殖会受到抑制，但已再生部分仍可继续增长和分化。再生原基的增殖和生长的维持需要神经营养因子的释放，这一现象在硬骨鱼和有尾两栖动物中都得到证实。例如，克鲤鱼属硬骨鱼的尾鳍再生需要支配。对神经组织的手术补充甚至能帮助肢体未受伤的蝾螈长出异位肢体。[5]

特殊性因素
再生组织
硬骨鱼和有尾两栖动物截肢后可再生出的组织有差异，前者为部分再生，后者则可完全再生。硬骨鱼的鳍由两部分骨骼组成，来源于不同个体发育过程。外层骨骼（鳞质鳍条和角质鳍条，由皮骨构成）在多种硬骨鱼中均可再生，但内层骨骼（软骨内成骨）不可再生。[1]有尾两栖动物肢体的各种组织，包括表皮、真皮、骨骼、肌肉、神经组织等均可再生。

位置信息的确定
硬骨鱼和有尾两栖动物截肢部位位置信息的可调性不同。有尾两栖动物肢体再生符合远端替代模型，其最经典的实验是Butler（1958）的P-D轴线颠倒再生实验。首先，肢体被从腕部截肢，并将残肢缝入后侧侧面体壁的口袋中。这一桥形肢体可同时从近端和远端由神经和血管支配。设原肢体最近端位置信息为10，最远端为1，截肢处近端为5，则现在此肢体具有位置信息“10-9-8-7-6-5”。之后，桥形肢体又被从中部在“7”、“8”间再次切断。实验结果显示，正常的近端残肢再生出具有位置信息“7-6-5-4-3-2-1”的远端肢体，而颠倒的远端残肢再生出位置信息为“6-5-4-3-2-1”的肢体。
这暗示（1）再生原基细胞能记忆原有沿P-D轴的位置信息（2）这种位置信息可能涉及细胞表面特性（3）这种位置信息不由残肢本身提供或控制，而是置于再生原基细胞内部，以及（4）当将细胞置于不同位置的环境中时，这种位置信息也不能被抹除或修改。这表明，有尾两栖动物再生原基的发育命运是确定的（determined），而与其近端所接的残肢组织无关，再生原基细胞从截肢发生处的肢体母细胞处得到位置信息。
硬骨鱼尾鳍再生原基的位置信息则表现出一定的可塑性。实验表明，截肢部位越靠近端，尾鳍再生的速度越快，显示再生原基沿P-D轴线不同地组织再生过程。然而，若将尾鳍按两齿的锯齿状截肢，确保最背部端和最腹部端的截点位于P-D轴线的同一水平，可发现两端的生长速率不同，最背部端的区域较最腹部端的区域生长快速。这显示其再生原基的生长是受周围再生原基或残肢细胞影响的（not determined）。
这种记忆的可塑性同样可以被鳍条的异位抑制试验佐证。当侧面的鳍条片段被移植至中间时，其可根据新的位置生长为有分支的中间鳍条形状，显示鳍条具有依赖于环境的形态发生可塑性。在Murciano等人的实验（2007）中，沿P-D轴线的可塑性也同样被证明。这种可塑性并没有在有尾两栖动物的再生原基中发现，显示两者的形态再生机制并不完全相同，其位置信息的储存也有所差异。[1]
再生相关基因的调控
一系列证据显示，表观遗传修饰在肢体位置信息记忆和再生基因的调控中起重要作用，但硬骨鱼和有尾两栖动物在表观遗传修饰上存在差异。[1]
在斑马鱼中，DNA甲基化状态与尾鳍再生过程有相关性，其可作为表观遗传标记区分激活的染色质（低水平甲基化）和失活的染色质（高水平甲基化）。在Thummel等人的研究（2006）中，分析了一些转基因组件中的启动子的甲基化状态。尽管在斑马鱼早期发育中，ef1-alpha启动子驱动了普遍分布的EGFP表达，EGFP信号在包括尾鳍在内的许多成年斑马鱼组织中消失。检测这些组织的甲基化状态，可发现启动子序列被高度甲基化，显示出基因沉默与DNA甲基化的较好关联。当尾鳍截肢后，这些EGFP信号又可在尾鳍再生原基中重新被检测到，原基处表现出低甲基化状态，显示再生原基细胞将转基因元件启动子去甲基化。实验显示，斑马鱼在启动肢体再生时，可将原有沉默的再生相关基因去甲基化而使之激活。
然而，DNA甲基化修饰在有尾两栖动物中有异。在蝾螈的再生原基中，存在表达Shh的细胞，且Shh肢体特异性增强子的甲基化水平足够低。然而，有尾两栖动物的成年肢体中，Shh肢体特异性增强子的甲基化水平也一直维持在很低水平，这使得其启动肢体再生过程时，不需要对某些再生相关基因去甲基化。[1]单从这一研究来看，有尾两栖动物中某些再生相关基因可能一直处于激活状态。其可能通过其它上下游基因的抑制或拮抗剂的表达维持稳态，或存在甲基化以外的表观遗传修饰方式。某些具有肢体再生能力的生物，也可能通过保持某些多能性基因在已分化组织中的表达，使自身对肢体再生做好准备。[3]

参考文献：
[1] K. Tamura, S. Ohgo and H. Yokoyama. (2010) Limb blastema cell: a stem cell for morphological regeneration. Develop. Growth Differ. 52: 89–99.
[2] N. Yoshinari and A. Kawakami. (2011) Mature and Juvenile Tissue Models of Regeneration in Small Fish Species. Biol. Bull. 221: 62-78.
[3] J. L. Whited and C. J. Tabin. (2010) Regeneration review reprise. J. Biol. 9:15.
[4] E. Nacu and E. M. Tanaka. (2011) Limb Regeneration: A New Development? Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27:409-440.
[5] V. P. Yin and K. D. Poss. (2008) New regulators of vertebrate appendage regeneration. Curr Opin Genet Dev. 18(4): 381–386.