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离子色谱法检测尿液和全血中的过渡金属

摘要：本应用手册描述了一种挑战传统光谱分析方法的采用离子交换分离机理的检测方法，对过渡金属进行定性定量。该方法具有良好的精密度和灵敏度，且无需复杂的样品前处理过程。

关键词：尿液；血液；过渡金属

体液中过渡金属含量的检测是临床化学研究者所感兴趣的一个研究课题。近几年的研究显示，一些临床的疾病是与人体体液中某种过渡金属的浓度有关的。如果尿液中铜含量比较低，则预示着Wilson病的存在。通过尿液中铜含量的研究还可以判断许多急性和慢性疾病，例如Hodgkin病、白血病以及其它很多恶性疾病[1]。锌与很多生物酶结合可以成为人体的营养物质，它是细胞生长和分裂的必需营养物，特别是在生物体成长速度较快的阶段。人体缺锌的症状是发育不良，身高矮小[2]。人们对铜和锌的生物学意义也很关注[3]。

一般说来，多数临床化学实验室采用原子吸收光谱（AAS）技术对体液中的过渡金属进行检测。但具有一定的局限性，火焰原子吸收光谱在检测铜时灵敏度较低，碳原子吸收光谱对于溶液中汽化的基体物质比较敏感，影响被测物的检测，这对体液的检测影响尤其明显[4-6]。体液中的蛋白质会造成吸收异常。

离子色谱法中，样品进入离子色谱交换柱后，由于与色谱柱固定相交换位点的亲和力不同，各种不同过渡金属络合物的色谱带以不同的速度经过色谱柱。柱后由气压控制加入一种强金属络合物显色剂，与色谱柱流出物相混合，并进入可见光波长段的吸收检测器进行检测[7]。可以通过更改淋洗液的配制来优化各种不同过渡金属的分离。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

戴安公司DX-500型离子色谱系统：GP 40梯度泵；AD 20 紫外吸收检测器；LC 20柱箱；PC10柱后衍生气控装置；PC 10自动控制装置（选配）；PeakNet色谱工作站（或Chromeleon工作站）；去离子水，电阻率17.8 MΩ-cm或更佳；硝酸，痕量金属级（Fisher Scientific）；硫酸（Fisher Scientific）；过氧化氢，30%（Fisher Scientific）；三氯乙酸（Fluka Chemika-BioChemika）

1.2 样品的处理

在一个250 mL的蒸发皿中加入10-100 mL样品，然后加入5 mL浓硝酸和2 mL 30 %的过氧化氢溶液，将蒸发皿以中等温度加热，将液体蒸发至15-20 mL。在蒸发皿上盖一玻璃盖以防止由于液体飞溅而造成的样品损失。将此浓缩液和所有沉淀物转移至含有5 mL浓硝酸的125-mL锥形烧瓶中。加入10 mL浓硫酸和少许沸石。在通风橱中加热蒸发，直至出现SO3浓烟出现。如果溶液呈现浑浊，再加入10 mL浓硝酸并再次进行蒸发处理。在进行下一步操作前移除所有硝酸。（所有的硝酸需在溶液变得澄清后并且不再有明显棕色烟气后移除）[8]。将剩余溶液冷却并用淋洗液定容至50 mL。

或者也可以用硝酸对样品进行酸化消解处理。加入40 g浓硝酸到大约75 g样品中。加入10-mL倍数的消解后样品到20 mL 2M乙酸铵溶液中。最终样品的pH值应大约为5.5。

对于尿液样品或组织液样品，可以加入三氯乙酸来将其中的蛋白质降解。加入0.2 mL 50 %的三氯乙酸溶液到0.4 mL尿液或者组织液中。将样品在1500转离心5分钟。将上清液直接进样。

1.3 色谱条件

有两种分析系统用来对过渡金属进行检测。最常用的方法是使用IonPac CS5A色谱柱进行色谱分离。IonPac CS5A是一种高效的有机溶剂兼阴阳离子两性交换分离柱。另外一种就是采用较老的IonPac CS5色谱柱进行分离。在分离效果和对镉的检测上，IonPac CS5A具有一定优势。表1给出了两种色谱柱的不同实验条件。

2 结果与讨论

2.1 方法的选择 ++

本方法可采用两种淋洗系统对这些被测物进行分离。第一种是使用PDCA淋洗液，PDCA是一种强络合剂，这样被测过渡金属可以通过阴离子交换机理实现分离。PDCA尤其适合二价铁、三价铁、铜、镍、锌、钴、镉和锰的分离（见图1，2）。此方法可以同时检测二价铁和三价铁的氧化物，但是由于二价铁非常容易被氧化成三价铁，故需先对淋洗液进行超声处理以移除其中的氧气。可以在分析前用0.1 M亚硫酸钠（12.6 g/LNa2SO3）冲洗色谱柱2小时，将进入色谱柱的氧气移除。

另外还可以采用草酸作为淋洗液，草酸是一种中等强度的络合剂，可以通过混合机理将金属进行分离。草酸淋洗液可以对铅、铜、钴、锌和镍进行很好的分离（见图3）。镉和锰会产生共淋洗。

图1.用CS 5A色谱柱不同淋洗液对过渡金属进行分离色谱图（A） PDCA淋洗液； （B）草酸淋洗液

图2 检测全血中的三价铁和锌 图3检测尿液中的铜和锌（IonPac CS5，PDCA淋洗液） （IonPac CS5，草酸淋洗液）

2.2 精密度和回收率

被色谱柱分离的金属从色谱柱流出后进入柱后反应装置与PAR试剂进行衍生化反应，之后进入紫外/可见光检测器于520－530 nm处进行检测。此方法适用于复杂样品基体如人体体液的分析。该方法具有灵敏度高、选择性好、精密度高等特点。不同体液样品的加标回收率结果如表2和表3所示。

3结论

样品分析的所有流路必须确保没有过渡金属污染物的存在。在配制和转移过程中要尽量小心以避免污染。配制好的PAR试剂很容易被氧化，当PAR试剂变成红色时，说明其已经被污染，需重新配制。配制好的溶剂应以惰性气体进行保护，如氮气或者氦气，并且最多只能使用两周。当柱后衍生液的外接气已经被打开时一定要确保泵已经开启，否则会造成柱后反应PAR试剂流入色谱柱。

参考文献

[1] Delves, F. E.; Alexander, F. W.; Lay, H. Brit. J. Haematol. 1985, 34, 101–107.

[2] Wells, J. L.; James, D. K.; Luxton, R.; Pennock, C. A. Brit. Med. J. 1987, 294, 1054–1056.

[3] Editorial, Nutr. Rev. 1984, 42, 184–186.

[4] Nixon, D. E.; Moyer, T. P.; Johnson, P.; McCall, J.; Ness, A. B.; Fjerstad, W. H.; Wehde, M. B. Clin. Chem. 1986, 32, 1660–1665.

[5] Delves, H. T. Prog. Anal. Atom. Spectrosc. 1981, 4, 1–48.

[6] Passey, R. B.; Maluf, K. C.; Fuller, R. Anal. Biochem. 1985, 151, 462–465.

[7] Rubin, R. B.; Heberling, S. S. Amer. Lab. 1987, 46–55.

[8] Franson, M. H. (Ed.) “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,” 15th
Edition, Amer. Public Health Assoc., Washington, D. C., 1985.