载体选择及工程菌构建过程中应注意问题.doc

一、获取目的基因
（一）来源
反转录法
反转录-聚合酶链反应法
化学合成法
对已发现的基因的改造
（二）用途
表达
分泌型表达
融合表达
包含体表达
根据目的基因及受体细胞综合考虑表达类型
克隆
二、重组
（一）载体的选择
表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体
克隆型载体：如pBR322，TA载体
不同要求的目的基因应按照需要，选择正确的载体类型。
（二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来
(1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法。
需要考虑的问题：1.克隆基因的酶切位点问题2.载体的酶切问题3.连接片段浓度比的问题
三、转化
（一）受体细胞（工程菌 ）的选择
大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌，酵母菌，昆虫细胞（家蚕），哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） ，植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
***重组和转化需要共同注意的问题
v 目的基因的稳定性，酶切位点
v 载体的酶切位点，选择标记
v 载体的拷贝数，载体和受体的相容性
v 受体的表达系统
v 目的菌对密码子的偏爱
四、筛选
（一）筛选方法
(1)遗传学方法
(2)物理筛选法
(3)核酸杂交法
(4)表达产物分析法
不同的载体，选用的筛选方法不同，应根据所选用的载体上所含的标记基因来确定。
（二）注意事项（蓝白班筛选法）
1.连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般连接粘性末端酶量的10-100倍。 　　 
 2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mgml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mgml。 　　 
 3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低效率。 　 
 4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 　　 

5.在连接反应中，如不对载体进行去5‘磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 　　 
 6.麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。 　　 
 7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的。 　　 
 8.在含有X-gal和IPTG的筛选上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。
五、表达
（一）分泌型表达
分泌表达形式的优点：
目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳稳定性大约是在细胞质中的10倍
目的蛋白易于分离
目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍

（二）包含体表达
包涵体表达形式的优点：
能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁

包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。

（三）融合表达
以融合形式表达目的蛋白的优缺点
目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳
目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白
目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件
目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性
目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段