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人幽门螺杆菌HspA亚单位的基因克隆及序列分析
【摘要】  目的： 获取幽门螺杆菌（Hp）热休克蛋白A（ HspA）亚单位基因并进行核苷酸序列分析和同源性比较。方法： 获取幽门螺杆菌的染色体DNA，PCR技术扩增获取HspA基因，将其定向插入pGEX-4T-1原核表达载体中进行核苷酸序列分析。结果： 经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功，DNA序列与Genbank 公布的序列比较有13个碱基存在差异，同源性为96%；由碱基序列推定编码的氨基酸残基序列没有发生变异，同源性为100%。结论： 成功地将Hp HspA基因克隆到了pGEX 4T-1原核表达载体，为HspA的表达和研究奠定了实验基础。
【关键词】  螺杆菌，幽门； HspA亚单位； 克隆，生物；基因顺序
    ［Abstract］ Objective: To get heat shock protein A （HspA）subunit gene of Helicobacter pylori, analyze its DNA sequence, and compare its homology. Methods: Chromosome DNA of H.pylori was extracted and the HspA gene was amplified with Polymerase Chain Reaction （PCR）. The obtained DNA fragment was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 and sequenced. Results: HspA gene was cloned successfully which was demonstrated by enzyme digesting and gene sequencing methods. Comparing with DNA sequences reported in Genbank, nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was 96% identical with that of HspA gene with a variation  of 13 base pairs. The homology in putative amino acids was 100%. Conclusions: HspA gene has been Cloned into prokaryotic expression vector pGEX 4T-1 successfully, which makes an experimental foundation for its expression and associated research.
    ［Key words］ Helicobacter pylori；HspA subunit；cloning, organism; gene order
    幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是上消化道的重要致病菌之一，其感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌［1］。在Hp的免疫治疗研究方面，纯化的尿素酶（Ure）和热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）及其亚单位成分均可作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用［2，3］其中，以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%的试验小鼠获得保护［4］。Hp是一种微需氧的革兰阴性杆菌，体外生长时对外部环境及支持物的要求十分苛刻。目前通过细菌培养获得大量Hp，并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。基因工程亚单位疫苗能克服这些不足，已成为Hp疫苗研究的主攻方向，目前寻找高效抗原、适合载体及合理的免疫途径是疫苗研究的焦点。pGEX-4T-1原核表达载体是谷胱苷肽巯基转移酶（GST）融合表达系统，是一种极好的基因表达和纯化系统。pGEX-4T-1位于tac启动子上，能用化学方法诱导高效表达产生融合蛋白；基因表达时，表达产物是GST与目的基因的融合体，而载体多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。 黄琛等［5］已将Hp CagA蛋白肽段的基因克隆到pGEX表达载体，获得了很好的表达。目前尚未见将pGEX-4T-1载体引入到Hp HspA亚单位疫苗研究中的报告。2003-2004年运用PCR技术扩增人Hp HspA基因，插入原核表达载体并对其进行基因序列分析和同源性比较，为处于探索阶段的Hp HspA亚单位疫苗的研制提供一条选择途径。
    1  材料与方法
    1.1  菌株和质粒
    Hp，E.coil  DH5a 和原核表达载体pGEX-4T-1由曹承华硕士惠赠。
    1.2  主要试剂
    水解酪蛋白琼脂Mueller-Hinton Agar购自杭州微生物试剂厂，两性霉素B、多黏菌素B、万古霉素购自华美生物公司，磺胺增效剂（TMP）购自贵阳制药二厂，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR1、Xho1购自上海Sangon；Plasmid Isolation kit、Gel Extraction kit购自Omega公司。
    1.3  方法
    1.3.1  Hp培养及鉴定  无菌操作方法接种液体菌液于新鲜的含抗生素的M-H血平板上，将血平板放入厌氧罐内，同时放入能产生混合微需氧气体的试剂，37 ℃电热恒温培养箱中孵育3～5 d。用菌落、细菌形态及生化反应（尿素酶、触酶和氧化酶试验）对培养物进行鉴定。
    1.3.2  Hp染色体DNA的提取  按照试剂盒说明书操作。
    1.3.3  HspA的PCR扩增
    1.3.3.1  PCR引物设计与合成  根据文献报告，设计1对引物，上游引物P1 5’-CGG AAT TCA TGA AGT TTC AAC CAT TAG-3’，引入EcoRI限制性内酶酶切位点，并保留了起始密码子ATG；下游引物P2 5’-CCG CTC GAG TTA GTA TTT TTT GTG ATC-3’，引入XhoI限制性内酶酶切位点，并保留了终止密码子TAA。引物经计算机分析软件Primer分析，由上海生工公司合成。
    1.3.3.2  PCR反应条件  在PCR反应管中加入DNA模板、4种dNTP混合液、上下游引物及Taq DNA 聚合酶等进行PCR扩增。循环条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,共35次循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃冷却终止反应。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭 5 mg/L）电泳进行检测。
    1.3.4  pGEX-HspA重组质粒的构建及鉴定  用Omega公司的胶回收试剂盒回收纯化新鲜的PCR产物（操作步骤按试剂盒说明书进行）将纯化后的PCR产物用EcoR1+Xho1进行双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。挑取单个含质粒pGEX-4T-1的细菌菌落接种入含氨苄青霉素（Amp）的LB培养液中培养后，提取质粒DNA，EcoR1＋Xho1进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。最后将均经过酶切纯化过的HspA PCR产物和pGEX-4T-1在T4DNA连接酶的作用下进行连接（总体积10 μl，16 ℃连接16 h），构建pGEX-HspA重组质粒。将连接产物转化E.coil DH5a感受态细胞，挑取具有Amp抗性的菌落于含Amp的LB培养液中37 ℃振摇过夜培养，抽取质粒，用EcoR1+Xho1双酶切进行鉴定。
    1.3.5  DNA序列分析  获取大量经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。
2  结果
    2.1  Hp HspA基因的PCR扩增 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条清晰的带，约350 bp，与预期结果一致（图1）。重组质粒的构建如图2。质粒提取试剂盒提取质粒后用EcoR1+Xho1进行双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳显示长度分别约为4.9 kb和0.35 kb的图2  重组质粒pGEXHspA构建示意图Fig.2  The scheme for construction of the recombinant plasmid pGEXHspA酶切产物，与预期结果一样（图3）。图3  重组质粒HspA/pGEX酶切鉴定图谱Fig.3   Identification of recombinant plasmid HspA/pGE by restriction analysis
　　2.2 pGEX-HspA重组质粒的DNA序列分析以pGEX-5’为引物测序，结果显示HspA基因已经插入到载体中，全长357 bp，是118氨基酸残图4  HspA/pGEX重组质粒测序图谱Fig.4  Sequencing picture of HspA/pGEX recombinant plasmid基组成的肽链，两端有XhoI和EcoR I酶切位点。利用chromas看图软件，与Genbank的基因序列比较，有13个碱基发生了改变，同源性96%（344/357）。由碱基测序结果推定氨基酸序列没有变异，同源性为100%。HspA/pGEX重组质粒测序图形及结果比较见图4、图5和图6。
    3  讨论
    Hsp是生物细胞在多种应激条件下诱导合成或合成增加的一类进化上高度保守的应激蛋白质［6］。研究已发现所有的Hp都含有丰富的Hsp，它们具有免疫原性、保护力、表面暴露和高度保守性。Hp的Hsp 编码基因属于双顺反子操纵子，包括HspA和HspB两个开放读码框架,可顺序表达。HspA包括两个区域：N区和C区。N区与GroES家族同源高度保守,是免疫显性区［7］；C区为“镍结合区”。由于HspA独特的结构和结合镍离子的特性，认为是激发机体产生预防Hp感染最有效的免疫成分之一［8］，这也使其在与尿素酶基因共表达时，可将尿素酶的活性增加4倍以上［7］。
    HspA基因全长357 bp，编码118个氨基酸。与Genbank公布的HspA基因的序列比较存在13个碱基的差异，同源性为96%（344/357）；根据所得基因序列推定的氨基酸序列未发现改变，同源性为100%。认为HspA基因发生变异的原因可能是使用的Hp菌株不同。菌株间存在很大的差异，不同患者感染的Hp具有特殊的限制性片段长度多态性图谱，尤其是不同地区差别更加明显，通常有好几个片段的差异［9］，但其高度的同源性又决定了不同菌株之间编码蛋白的主要抗原决定簇的一致性。Hp菌株基因水平的多态性并没有改变基因表达的蛋白质序列，这主要是大部分变异在密码子的第3个位置上发生了沉默突变。氨基酸遗传密码子的简并性是造成沉默突变存在的重要原因，这可使基因更加耐受失败的突变，从而保证了物种的稳定性。国内外学者在对不同种属的Hp Hsp研究中发现，尽管编码Hsp的基因存在差异，但其氨基酸序列仍然相当保守。本实验利用PCR技术获得了特异的Hp的HspA DNA并进行序列分析，为以后相关研究奠定了重要的实验基础。
【参考文献】
  ［1］Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al.Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma［J］. N Engl J Med, 1991（325）:1127-1131.
［2］Gomez Duarte OG, Lucas B, Yan ZX, et al Protection of mice against gastric colonization by Helicobacter pylori by single oral dose immunization with attenuated Salmonella typhimurium producing urease subunits A and B［J］. Vaccine, 1998（5）: 460-471.
［3］Ferrero RL, Thiberge JM, Kausau I, et al. The GroES homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995 （14）:6499-6503.
［4］Marchetti M, Arico B, Burroni D, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori infection that mimics human disease ［J］. Science, 1995 （5204）:1655-1658.
［5］黄琛，佘菲菲，陈月秀.幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆、表达及抗原性检测［J］. 福建医科大学学报，2003（37）：60-63.
［6］范学工，夏华向.幽门螺杆菌感染——基础与临床［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1997：33-35.
［7］Kansau I, Guillain F, Thiberge JM, et al. Nickel binding and immunological properties of the C-terminal domain of the helicobacter pylori GroES homologue （HspA）［J］. Mol Microbiol, 1996 （5）:1013-1023.
［8］Suerbaum S, Thiberge JM, Kansau I, et al. Helicobacter pylori hspA-hspB heat-shock gene cluster: nucleotide sequence, expression, putative function and immunogenicity［J］. Mol Microbiol,1994 （5）:959-974.
［9］Langenberg W, Rauws EA, Widjojokusomo A, et al. Identification of Campylobacter pyloridis isolates by restriction endonuclease DNA analysis［J］. J Clin Microbiol, 1986 （3）:414-417.