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高效液相色谱在食品安全中的应用
（邹同婷，山东师范大学人口资源与环境学院环境本0901）
摘要：
高效液相色谱法作为化学分离分析的一种极其重要的手段，在食品安全领域有着及其广泛的应用。本文将介绍高效液相色谱法在三聚氰胺的检测中的应用、高效液相色谱法在食品添加剂中的检测中的应用以及高效液相色谱法在农药残留检测中的应用。
关键词：高效液相色谱；食品安全；三聚氰胺；食品添加剂；食品添加剂；农药检测残余；山梨酸；苯甲酸
High performance liquid chromatography in food safety applications
Abstract :High performance liquid chromatography as a chemical separation and analysis of a very important means in the field of food safety, with its wide application. This paper introduces the high performance liquid chromatography in the detection of melamine, the application of high performance liquid chromatography in food additives in the detection and the application of high performance liquid chromatography used in detection of pesticide residues.
Key words: high performance liquid chromatography; food safety; melamine; food additives; food additives; pesticide detecting residual; sorbic acid; benzoic acid
色谱法又被称为“色谱分析”，是一种分离和分析方法，在分析化学以及生物化学领域有着极其重要的应用。色谱法的主要原理是，根据不同的物质在不同相态中的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，这样一来，混合物中不同的物质会以不同的速度沿着固定相移动，最终达到分离的目的。色谱法有着分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少的特点。在食品分析中有着较为广泛的应用。高效液相色谱法简称HPLC，是在20世纪60年代末70年代初发展起来的，我国高效液相色谱技术的应用开始于20世纪70年代，从20世纪90年代开始，HPLC开始被列入检测食品中营养成分、添加剂以及有害物质的国标方法。
一、 高效液相色谱法在三聚氰胺检测中的应用
三聚氰胺是一种产自煤的化学物质，大多用于生产塑料以及肥料，是一种化工产品，不是食品添加剂，不能用于人的食品当中，会对人的身体健康以及生命安全造成极其严重的损害，“三鹿奶粉”就给我们敲响了警钟。
目前检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法、气相色谱质谱联用法、液相色谱质谱联用法。其中液相色谱质谱联用法由于能够快速地对三聚氰胺定性与定量，已成为大家首选的检测方法。质谱法是通过将试样分子裂解为分子离子和各种离子碎片的集合，并按质荷比（m/z）大小进行分离、记录其信息的分析方法。质谱法具有分析速度快、灵敏度高以及谱图解析相对简单等优点。根据质谱图提供的信息可进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、试样中各种同位素比例测定及固体表面的结构和组成分析等。无论是哪种类型的质谱仪都有把试样分子转化为离子的离子源，把不同质荷比的离子分开的质量分析装置和可以得到试样质谱图的检测装置。
（一）高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中三聚氰胺残留
鸡蛋是人们生活中日常食用的营养食品之一，为了保证鸡蛋的食用的安全，去建立一种快速而有效的检测鸡蛋中三聚氰胺残留的分析方法是非常必要的。
目前测定三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法、气象色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法，其中液相色谱—串联质谱法有着选择性强、灵敏度高以及特异性好的特点是最佳的三聚氰胺分析方法。
目前测定三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法等。气相色谱-质谱法能够进行确证分析,但需要衍生化,比较繁琐;液相色谱法不用衍生,但灵敏度较低且无法提供结构信息;液相色谱-串联质谱法具有选择性强、灵敏度高和特异性好等优点,是最佳的三聚氰胺确证分析方法。笔者采用1%三氯乙酸-甲醇(体积比1∶1)提取鸡蛋样品中的三聚氰胺残留,然后用PCX固相萃取柱净化,利用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS),优化了液相色谱条件和质谱条件,建立了鸡蛋中三聚氰胺残留的确证和定量测定方法。
（二）反相高效液相色谱法测定金属灌装饮料中三聚氰胺单体迁移量
有研究表明，在食品包材如塑料制品中会存在三聚氰胺，从而导致三聚氰胺迁移到食品中去，食用后会对人的身体造成危害，这里可用反相高效液相色谱法对金属罐内壁涂层浸泡液迁移出的三聚氰胺进行检测。
检测所需要的仪器主要有高效液相色谱仪、高速冷冻离心机、固相萃取仪、超声波水浴器。主要试剂为甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；氨水甲醇(5%)；三氯乙酸(10 g/L)；柠檬酸；庚烷磺酸钠；三聚氰胺标准品。实验步骤主要为：①样品的选购。可以在超市选取不同的品牌、不同的种类的饮料瓶。②将灌装包材的内壁涂层刮落，分别用不同的方法进行浸泡处理。③浸泡条件水:60℃，2 h；乙酸(4%):60℃，2 h；乙醇(65%):室温，2 h;正己烷:室温，浸泡2 h。④样品前处理内涂层浸泡液用0．45μm的有机相滤膜直接过滤至进样瓶，待进样。⑤绘制标准曲线以及回归线方程。用流动相将三聚氰胺标准储备液(1.0 mg)逐级稀释得到的浓度为0.20μg、0.50μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积－浓度作图，得到标准回归方程.计算三聚氰胺的含量。
二、高效液相色谱法在食品添加剂的检测中的应用
（一）高效液相色谱法测定肉制品中的山梨酸、苯甲酸
《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-2011)中规定，熟肉制品加工可以添加山梨酸或山梨酸钾，使用量不大于0.075g/kg，苯甲酸在熟肉制品中不得使用。目前，国标GB/T 5009.29-2003中规定检测山梨酸、苯甲酸的方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。由于肉制品中含有大量的脂肪，传统提取净化方法很难将脂肪从提取溶液中去除，从而污染色谱柱。而高效液相色谱法采用固相萃取来净化高脂肪样品，可以消除脂肪的干扰，过程简单快速，使用有机溶剂少，重现性好，回收率高，是一种准确、可靠的检测肉制品中苯甲酸、山梨酸的方法。
由于苯甲酸、山梨酸的水溶性较差，可以利用超声波的强烈振动作用和击碎作用来处理样品。试验表明。当苯甲酸、山梨酸在超声作用10min后，其在水中的溶解度超过0.1g/100mL，这对于5g的取样量来讲已经足够，因此实验选用10min来处理样品。
另外，①pH值的影响：考察pH值的变化对苯甲酸、山梨酸在SPE小柱上吸附效率的影响，结果发现，当pH值为中性时，苯甲酸、山梨酸在SPE小柱上几乎不吸附，而随着pH值的降低，吸附量随之增大，当pH值小于4时，达到完全吸附。考虑到SPE小柱在pH值小于2时会发生降解，所以实验萃取时调样液pH值等于3.5左右。
此外，为了尽可能减少干扰影响和得到最大的回收率，我们进行了洗脱试验。取5mL分别含50mg/L的苯甲酸、山梨酸标准品，参照样品进行处理。分别以5mL纯水、10%～100%的甲醇溶液洗脱，测定洗脱液中苯甲酸、山梨酸的含量，计算回收率。试验结果表明，以纯水洗脱时无苯甲酸、山梨酸洗脱，而用大于70%甲醇洗脱时，苯甲酸、山梨酸的回收率均接近于100%。故实验采用70%甲醇洗脱，用纯水清洗。
并且在试验苯甲酸、山梨酸在不同比例乙酸铵-甲醇时的分离效果的时候，发现乙酸铵-甲醇比例为75：25时的分离效果最好，而且分析时间较短。
由此可以确定实验条件如下。色谱柱条件为色谱柱:HC-C18 150mm×4.6mm×5um色谱柱；流动相：乙酸铵（0.02mol/L）：甲醇,体积比为75：25；流速：1.0mL/min；检测波长：240nm；柱温：30℃，制备药品时超声波清洗器中超声10min，pH=3.5，0.45μm滤膜过滤。
（二）高效液相色谱法测定食品中抗氧化剂BHA,BHT,PG
人们为了让食品保鲜,经常要在食品中添加一定量的抗氧化剂。但抗氧化剂过量,会损害人体健康。合格食品的抗氧化剂的添加量,必须符合国家卫生标准[1,2]。对食品中抗氧化剂的测定一直沿用薄层法、比色法、气相色谱法[3]。报道的HPLC法只是用于油样的测定,且前处理要用乙腈反复萃取,不仅操作繁杂,而且乙腈的毒性太大,价格昂贵。这里介绍一个同时、快速、准确地分析食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和焦性没食子酸丙酯(PG)的高效液相色谱法。
主要试剂Waters-201型高效液相色谱仪,M-490型紫外检测器,680型溶剂梯度仪,740型数据处理机,U6K进样器。正己烷为分析纯,乙醇为优级纯,甲醇为色谱纯,水为高纯水。BHA,BHT,PG均为德国E.Merok产品,纯度为99.98%。色谱柱为Radial-PAK C18,流动相为甲醇-水(92¨8,V/V),用H3PO4调pH为3.0,流速为0.8mL/min,柱温为室温,检测波长为280nm,检测灵敏度为0.05Aufs,进样量为10μL。
经紫外扫描,采用280nm作为它们的吸收波长,获得了理想的色谱图,PG,BHA,BHT的保留时间分别为3.598min,4.455min,6.431min。
由此可见，同时、快速、精确测定抗氧化剂BHA,BHT,PG的高效液相色谱法。此法简便、准确、回收率高、重现性好。另外，此方法除了适用于食品的测定外,还适用于饲料的测定。
三、高效液相色谱法在农药检测残余中的应用
我国是农业大国,也是农药消费大国。农业生产中长期使用农药不但对人畜有一定的毒害作用,而且也会对环境和生物链造成极大的破坏,进而对生命机体产生“三致”作用(致癌、致畸、致突变)。水果蔬菜上的农药残留问题由来已久。随着人们生活水平的逐步提高,水果蔬菜质量安全问题已成为制约我国果蔬产业发展的重要因素,加强水果蔬菜质量安全控制,对提高果蔬质量安全水平,促进果蔬产业健康发展具有重要意义。
高效液相色谱柱后衍生化法检测氨基甲酸酯类农药残留能避免涕灭威高温下分解，气谱检测不稳定的问题与液相色谱-紫外检测法相比较，具有检测限低，选择性和灵敏度高，杂质干扰小，对复杂基体中的农药残留具有较强的定性能力，准确度高等优点。
（一）高效液相色谱法在检测蔬菜中氨基甲酸酯类杀虫剂农药残留中的应用
氨基甲酸酯类杀虫剂的杀虫作用机制为抑制昆虫神经传导的重要物质--乙酰胆碱酯酶(AChE)。氨基甲酸酯类农药进入虫体后,与AChE结合,形成氨基甲酰化酶,使AChE无法水解乙酰胆碱(ACh),致使神经突触部位ACh大量积累,对突触后膜产生连续不断的刺激作用。昆虫在连续不断的神经刺激下,出现兴奋、痉挛、最后瘫痪、死亡。氨基甲酸酯类杀虫剂由于其对多种害虫的良好的杀虫效果被广泛使用于各种作物,而其中的高毒品种呋喃丹等经常被农民滥用于蔬菜、水果上,导致人体急性中毒、影响人体健康。另外氨基甲酸酯类杀虫剂也存在对地下水的污染问题。
高效液相色谱柱后衍生化法检测氨基甲酸酯类农药残留,选择性强,灵敏度高,重现性好。世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织(FAO)和许多发达国家都把此方法作为检测氨基甲酸酯类杀虫剂残留的标准方法。
该方法的原理是氨基甲酸酯类农药在碱性条件下水解产生甲胺,甲胺与衍生化试剂邻苯二甲醛(OPA)、巯基乙醇反应,生成强荧光物质,可以以荧光检测器检测。
高效液相色谱法有着诸多的优点。色谱稳定性氨基甲酸酯类杀虫剂存在气相色谱检测不稳定的问题,部分氨基甲酸酯类农药,如涕灭威、甲萘威等气谱分解,导致检测结果不稳定。以高效液相色谱柱后衍生系统、荧光检测器检测时,被测成分稳定,同时由于液谱的定量环进样,重现性好。另外，以高效液相色谱柱后衍生系统、荧光检测器检测氨基甲酸酯类杀虫剂时,蔬菜样本中很少含有带-CONH-集团的物质,很难衍生生成具有荧光的物质,所以样本及溶剂中的杂质产生干扰很小。
（二）高效液相色谱法检测黄瓜中涕灭威及其代谢物的残留量
涕灭威系氨基甲酸酯类农药,是一种高效、剧毒、广谱、内吸性的杀虫、杀螨、杀线虫剂,它的主要代谢物涕灭威亚砜和涕灭威砜具有很高的水溶性和毒性,许多国家和地区对这类农药在水果、蔬菜中的残留限量都制定了严格的限量标准。目前,涕灭威在蔬菜上的残留检测方法多是采用气相色谱法(GC),但由于缺乏热稳定性,在对其进行GC测定时,可能会造成分解,且缺乏灵敏度高的选择性检测器。本试验采用固相萃取技术,快速、简单地提取黄瓜中的涕灭威及其代谢物,并用高效液相色谱分离、梯度淋洗、柱后衍生、荧光检测器检测,定性定量地分析黄瓜中涕灭威及其代谢物的残留量。
用高效液相色谱法来进行检测有很明显的优点。首先，涕灭威用气相色谱检测存在因气谱分解导致检测结果不稳定的问题。而用高效液相色谱柱后衍生系统-荧光检测器检测时,衍生较好,待测成分稳定,重现性好；其次，由于荧光检测器具有对荧光物质的选择性,使得样本中涕灭威出峰无杂质干扰,分离度较好,提高了方法的灵敏度,保证了分析样品的准确性;同时,样品通过固相萃取柱的净化,有效去除了一些极性高的强荧光物质,保护了检测器和色谱柱,延长了其使用寿命。
总之，HPLC已经越来越广泛的应用到食品检测与安全性分析中，近年又与其他的色谱相互结合，扩大了检测范围，提高了检测水平，可更快速准确地检测出食品中残留的微量、痕量毒素。随着技术的不断完善和发展，HPLC必将在食品检测与分析领域有更广阔的发展。
参考文献：
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