植物组织培养设备及条件PPT文档.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章,实验室,设计,和培养条件,第一节 实验室设计及基本技术,第二节,植物组织培养所要求的环境条件,1第一节 实验室设计及基本技术,一、实验室组成,二、仪器设备,三、培养器皿,及实验用具,四、洗涤技术,五、灭菌技术,六、无菌操作,2,组织培养实验室布局的总体要求,便于隔离,便于操作,便于灭菌,便于观察,一,、实验室组成,3,基本实验室,辅助实验室,实验室组成,准备室,缓冲室,无菌操作室,培养室,细胞生物学实验室,温 室,生化分析实验室,4,水槽,实验台,搁架,培养架,培养架,培养架,培养架,药品及仪器柜,无菌台,无菌台,搁,架,拉窗,冰箱,搁 架,电炉,门,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,准备室,缓冲室,无菌室,培养室,5,组织培养准备实验室,6,准备室,7,缓 冲 室,8,无 菌 室,9,无 菌 室,10,培 养 室,11,培养架,12,培养间,13,二、仪器设备,1,）、基本仪器设备,冰箱、电（磁）炉、,酸度计,、纯水器、,天平,、,移液器,、解剖镜、,光照培养箱,、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。,14,冰箱,酸度计,电炉,15,天平,纯水,器,16,培养基分装器,搅拌器,17,摇 床,体式显微镜,倒置显微镜,冷光源,电磁搅拌器,摇床,18,2,）、灭菌设备,蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。,19,蒸汽压力灭菌锅,20,21,高,压,灭,菌,器,22,干热消毒柜,23,75%,酒精喷雾器,喷雾消毒器,24,3,）、无菌操作设备超净工作台,25,二、设备、仪器,超净工作台,（一）设备,26,1.,紫外线灭菌灯,2.,日光灯,3.,工作台,4.,凳子,5.,搁物架,6.,窗,7.,推拉门,8.,缓冲间,27,28,无菌接种箱,29,4,、细胞培养设备,摇 床,30,培养架,31,HZC-250,恒温振荡培养箱,150C250D,光照培养箱,32,光照培养箱,烘箱,33,5,、细胞学鉴定设备,光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜,倒置显微镜,光学显微镜,34,电子天平,（,0.0001g,，,0.001g,）,酸度计,35,1,、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,36,2,、金属材质用具,镊子,解剖刀,接种针,37,（二）各类器皿,1,器皿的类型,（,1,）培养器皿,三角瓶,、培养瓶、圆形培养瓶、,试管,、,L,形管和,T,形管,（,2,）分注器,（,3,）刻度移液管,（,4,）,微量移液器,（,5,）,细菌过滤器,（三）器械用具,打孔器,镊子,解剖刀,接种针,剪刀,电热灭菌器,38,四、洗涤技术,1,、玻璃器皿洗涤,已用过的玻璃器皿,1%,稀,HCl,浸渍,12h,洗衣粉洗涤,清水冲洗,晾干备用,新购置玻璃器皿,39,2,、塑料用品洗涤,新的塑料器皿打开即用,已用过的塑料器皿,2%NaOH,浸泡,12h,清水冲洗,2%5%,盐酸浸泡,30min,清水冲洗,蒸馏水冲洗,晾干备用,40,3,、金属用品洗涤,热洗衣粉水洗净,冲洗,擦干,41,五、灭菌技术,物理方法,：,干热、湿热、射线处理、过滤除菌等,化学方法,：,消毒剂、抗菌素灭菌,1,、灭菌方法,42,2,、灭菌,（,1,）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法,压力在,0.1M0.2MPa,温度在,121,灭菌,1030min,（,2,）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌,干热消毒灭菌,43,饱和蒸汽压力与其对应的温度,饱和蒸汽压力,温度（,）,饱和蒸汽压力,温度（,）,kg/cm,2,1b/m,2,kg/cm,2,1b/m,2,0.0,0.141,0.281,0.442,0.563,0.703,0.844,0.984,0,2,4,6,8,10,12,14,100,103.6,106.9,109.8,112.6,115.2,117.6,119.9,1.055,1.125,1.266,1.406,1.543,1.681,15,16,18,20,22,24,30,50,121.0,122.0,124.1,126.0,127.8,129.6,134.5,147.6,44,（,3,）,塑料器皿灭菌：,多采用,高压蒸汽消毒灭菌,（,4,）金属用具灭菌：,灼烧灭菌,浸入,95%,酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用,45,（,5,）接种室灭菌,空气消毒灭菌,接种室,超净工作台,紫外灯照射,70%75%,的酒精擦洗,培养材料的接种,紫外灯照射,46,（,6,）外植体灭菌,流水冲洗,1020min,或更长时间,70%75%,酒精中浸泡,30s,0.1%0.2%,氯化汞,液中浸泡,10min,左右,蒸馏水冲洗,45,次,在,10%,的,次氯酸钠,、饱和,漂白粉,浸泡,30min,左右,备用,47,常用消毒剂消毒灭菌比较表,消毒剂,使用浓度（,%,）,去除难易,消毒时间（,min,）,效果,次氯酸钙,次氯酸钠,漂白粉,溴水,过氧化氢,升汞,酒精,抗生素,硝酸银,910,2,饱和溶液,12,1012,0.11,7075,45,（,mg/L,1,易,易,易,易,最易,较难,易,中,较难,530,530,530,210,515,210,0.22,3060,530,很好,很好,很好,很好,好,最好,好,较好,好,48,消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。,打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射,40min,左右，后关闭。,开启过滤风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。,用,70%75%,的酒精擦拭工作台和双手,。,（,7,）接种准备,49,六、无菌操作,实验员消毒,实验室、无菌台灭菌,实验器材的灭菌,无菌接种,消 毒,实验台卫生,培养室培养,50,植物组织培养是在严格,无菌的条件下,进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要,人工控制温度、光照、湿度,等培养条件。,准备室,：器具的洗涤、干燥保存、灭菌，各种药品的储备、称量、溶解、配制、培养基分装等，,设备：,药品柜、防尘厨、冰箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱。,实验室设计原则：,保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。化学室,/,准备室、接种室、培养室。,小 结,51,接种室：,植物材料的消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、原生质体制备及其它需要进行的无菌操作。,设备：,紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针）。清洁和消毒，减少与外界空气对流，,穿实验服及换鞋,以减少带入杂菌。,培养室：,墙壁要求,绝热防火的性能,，培养架由金属制成，底层离地高约,10cm,，,层间隔,40cm,总高,1.7m,左右，长度根据日光灯的长度而设计，,宽度为,60cm,。,52,第二节 植物组织培养所需的环境,条件及营养成分,一、环境条件,与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到,温度、光照、湿度,等各种物理条件，不同,培养基,组成、,pH,值、渗透压,等各种化学条件，以及,外植体部位、大小、细胞密度,等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。,53,温度,光照,湿度,气体,渗透压,pH,值,一般最适温度在,252,之间,环境条件,最常用的是,光照,16h,，黑暗,8h,一般情况下，培养器内相对湿度应达,100%,，培养室内环境的相对湿度在,70%80%,氧气,是愈伤组织生长所必需的,调节渗透压常常从,糖,入手,培养基的,pH,值大多在,5.06.5,，,5.8,54,温度在,20-27,左右，空调控温，湿度恒定，相对湿度在,70-80%,，光照由定时开关控制，每天,光照,10-16h,左右，不同植物决定光照时间，培养室可采用太阳光为能源，易成活，阴雨天用室内灯光补光。,55,二、营养成分,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：,a,、组成各种化合物，参与机体的建造，成为,结构物质,；,b,、构成一些特殊的,生理活性物质,，参与活跃的新陈代谢；,c,、元素之间相互协调，以维持,离子浓度平衡,、胶体稳,定、电荷平衡点等化学方面的作用；,d,、,发育方面,，特定的元素影响植物的形态发生和组织、,器官建成。,56,Arnon,和,Stout,（,1939,）提出的确定植物必需营养元素的,3,个标准,:,A,、缺乏该元素，,植物生育发生障碍,，不能完成其生活史,;,B,、缺乏该元素，就表现为专一的,病症,，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复,;,C,、该元素在,植物营养生理上表现直接的效果,，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的变化而产生的间接效果。,57,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有,16,（,17,）种：,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,Mg,、,S,、,Fe,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Mo,、,Cl,、（,Ni,）,在植物中,含量,差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,58,根据植物体内含量多少，可把这些元素分为,大量营养元素,：占干物质重量的,0.1%,以上；,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,等,9,种,微量营养元素,：占干物质重量的,0.1%,以下，有的只含,0.1mg/kg,，,Fe,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Mo,、,Cl,等,7,种,按照国际植物生理协会的建议：,所需浓度,0.5mmol/L,的元素为大量元素,所需浓度,0.5mmol/L,的元素为微量元素,59,1,、大量元素,N,是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。,P,是磷脂的主要成分。培养基中常用,KH,2,PO,4,、,NaH,2,PO,4,等。,K,对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,60,Mg,、,S,、,Ca,是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；,S,是含,S,氨基酸的蛋白质的组成成分。,Ca,是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，,Ca,及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,61,2,、微量元素,在微量元素中，,铁,的使用最大：,一些氧化酶的组成成分,叶绿素形成的必要条件,使用乙二胺四乙酸铁（,EDTA-Fe,）鳌合物防止铁的沉淀,62,硼,与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系,铜,是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长,锰,参与植物的光合、呼吸代谢,钼,参与氮素的代谢,氯,是光合作用水光解的活化剂,微量元素的主要作用是作为,酶的辅助因子或激活剂,参与代谢的调节,。,63,组织培养的条件,营养条件,（培养基），组织培养的重要基质，不同植物的组织对营养有不同的要求，合适培养基才能成功。,MS,培养基,：,1962,年由,Murashige,和,Skoog,为培养烟草细胞设计，无机盐浓度较高，硝酸盐含量高，用于,植物器官、花药、细胞,的组培，有些培养基是由它演变而来。,B5,培养基,：,1968,年由,Galmborg,为培养大豆,根细胞,设计，含有较低的铵盐，适合双子叶植物、木本植物,64,White,培养基,：,1943,年由,White,为培养番茄,根尖,设计，,MgSO4,、硼盐浓度高，无机盐浓度低，适于生根培养。,N,6,培养基,：,1974,年由朱至清为禾谷类,花药培养,而设计，,KNO,3,和（,NH,4,）,2,SO,4,浓度高，适于花药培养。,KM-8P,培养基,：,1974,年为,原生质体培养,而设计，有机成分复杂，包括了所有的单糖及维生素，适于原生质体融合培养。,65,培养基,成分主要是,水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中的凝胶,无机盐,：大量元素（大于,0.5mmol/L,的元素）、微量元素。,N,：,是蛋白、维生素、核酸、磷脂等的组成成分，培养基中有,NO,3,-,、,NH,4,+,供应形式，如,KNO,3,、,NH,4,NO,3,、（,NH,4,）,2,SO,4,等。,P,：磷脂、,ATP,等的组成成分，常用的有,KH,2,PO,4,、,NaH,2,PO,4,等,K,：与糖类合成、蛋白代谢有关，常以,KCL,、,KNO,3,在培养基中提供,Mg,、,S,、,Ca,：是叶绿素、酶、细胞壁的组成成分，,MgSO,4,7H,2,O,、,CaCL,2,7H,2,O,66,微量元素：,小于,0.5mmol/L,，,Fe,、,Zn,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Mo,、,Co,等；,FeSO,4,7H,2,O,与,Na,2,-EDTA,配成,铁盐溶液,。,碳水化合物：,常用的是蔗糖、葡萄糖，常用浓度为,3%,。,维生素：,以辅酶的形式参与多种代谢，对生长、分化有促进作用，,V,B1,（盐酸硫胺素）、,V,B6,（盐酸吡哆醇）、,V,B12,、,VPP,（烟酸）、,V,C,（抗坏血酸）、生物素、叶酸。,肌醇：,环己六醇，参与细胞壁、细胞膜构建，,100mg/L,67,氨基酸,-,有机氮源，细胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，,10-1000mg/L,天然复合物,-,椰子乳、香蕉、马铃薯滤液、酵母提取液、麦芽提取液、番茄汁等，不易培养时使用。,植物激素,-,培养基的关键物质，生长素类（,IAA,、,NAA,、,IBA,、,2,4-D,；细胞分裂素（,6-BA,、,KT,、,ZT,）；赤霉素（,GA,3,）,生长素,/,细胞分裂素,：高,利于根、愈伤组织形成；适中,利于根、芽分化；低,利于芽的形成,68,培养基的支持物,琼脂（固体培养时的固化剂，低于,40,度为凝胶，,6-10g/L,），玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是降低培养材料产生的有害物影响,抗生素,-,卡那霉素、头孢、青霉素、链霉素、庆大霉素等，,5-20mg/L,，防止菌类污染。,活性炭,-,吸附培养基中的杂质、酚、醌类、灭菌副产物等，,0.5-10g/L,69,70,71,72,缺铁症状,：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,73,74,75,76,77,78,缺铜症状：,新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点，扩大变成深褐色，引起落叶。,枝顶端生长不良，下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,79,80,81,缺锰症状：,叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,82,梨缺锰症,8384,缺钼症状：,叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。,十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,85,86,87,缺硼症状：,受精不良，籽粒减少，,“,花而不实,”,，,“,蕾而不花,”,；,根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；,常引起各种腐烂病。,马铃薯,88,89,缺锌症状：,小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。,90,植物缺素症,缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；,缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；,缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的,节间变短；,缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；,缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；,缺锰,：新叶脉间失绿；,缺铁,：叶片黄，叶脉绿；,缺硼,：顶芽和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；,缺锌,：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；,缺铜,：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；,缺钼,：不能形成花器或花早落。,91,