抗原修复方法及注意事项.doc

柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)
1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠
2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500W电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。
3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.1
4.操作步骤：
(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却)，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项：
(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。
(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。
(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后才能把切片取出。
(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine(
(5)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
EDTA 抗原热修复法
1. 适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。
2. 仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。
3. 所需试剂：EDTA抗原修复液，pH9 .0
4. 操作步骤：
(1)抗原修复液的配制：根据所需工作液的量，取迈新公司产品MVS-0098适量，按1:50 的比例稀释。
(2)取500ml 抗原修复工作液于1000ml 不锈钢锅中，直接在电磁炉上加热至沸腾后，调低电磁炉功率使锅内修复液保持微沸状态。将组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中(注意：若快速将染色架丢进缓冲液中，往往会导致瞬时的激烈沸腾现象而造成组织脱落)，之后加盖继续加热20 分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开，室温下自然冷却至室温后取出切片，蒸馏水洗1 次3 分钟，PBS 洗2 次、每次3 分钟。之后进行免疫组化染色。
5. 注意事项：
(1)由于修复液蒸发量无法估计，所以修复液不能重复使用。
(2)工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。
(3)为了防止加热过程组织脱片，须采用 Poly-L-Lysine处理载玻片。
(4)抗原修复后一定要等工作液冷却后，才能将切片从工作液中取出。
柠檬酸缓冲液微波抗原修复法
1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果比高温高压修复差但比直接水煮好。
2.仪器设备：微波炉(700-800w)。
3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.1
4.操作步骤：
(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(缓冲液量不得<500ml)于微波盒中，微波加热直 至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲 液中，中高档或中档继续微波处理15-20分钟；取出微波盒冷却至室温，从缓冲液 中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分 钟(2×3')。
(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项：
(1)微波时间长短的控制很重要，从组织切片放入沸腾的缓冲液到微波结束的总时间 控制在15-20分钟为好。
(2)必须使用耐高温塑料切片架，不能使用不锈钢或铜架。
(3)微波过程中，如果缓冲液蒸发而量减少，无法浸泡到组织片，应该适当加上一些蒸馏水，以保证组织片都能浸泡在缓冲液中，继续微波。
(4)微波结束后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
(5)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine( Devil缓冲液的量(>500ml)，必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法
1.适用范围：适合于中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果比高压修复法差。
2.仪器设备：电炉(600W)、烧杯(1000ml)等。
3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.1)。
4.操作步骤：
(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮20分钟；烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项：
(1)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防pH值改变而导致掉片 。
(2)煮好后必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
(3)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine(
(4)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
影响抗原热修复的关键因素
免疫组织化学染色中最关键的步骤莫过于抗原的修复了，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，可以这样说，抗原热修复是免疫组化的关键技术，会直接影响到最终的染色结果。
1、抗原热修复温度和时间的关系
组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如示：上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：
　　　　抗原热修复的有效性=加热温度（T）×加热时间（t）
也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就会越长；反过来当修复温度增高时则修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表一中也可以清楚地看出。如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露出的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要
2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
　固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也会相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。这就提醒我们在做回顾性研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。
3、不同pH值抗原修复液对染色结果的影响
　　抗原热修复中所使用的修复液pH值也会对染色结果产生相当大的影响。pH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。
A — 稳定型，pH值对染色结果的影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B — V型，高pH值和低pH值染色较好，而pH值4-6染色结果较差，如ER、Ki-67等。
C — 上升型，随着pH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。
D — 下降型，随着pH值的增加，染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。
一个有趣的现象值得注意，即在高pH值（约pH8.0~9.0），A、B、C三者都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高pH值的修复液，如1mM EDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用pH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高pH值的修复液来代替目前广为使用的pH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用pH9.0的修复液效果都要优于pH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高pH值的抗原修复液是今后的必然趋势。
4、抗原热修复的手段
　　目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种。高压修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点。
5、抗原热修复具体操作过程
　　可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以1mM的EDTA抗原修复液（pH8.0或pH9.0）效果最好。