肿瘤研究方法.ppt

ApproachesandTechniquesinResearchonTumorAcourseforPh.D.candidates1.肿瘤的瘤的实验动物和物和细胞研究技胞研究技术The animal model and in vitro research of tumor2.常用研究方式：常用研究方式：InVitro:体外研究，细胞、组织培养下进行InVivo:体内研究，人类疾病的动物模型ExVivo:细胞经体外实验处理后，再回输到体内体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等3.体外研究(InVitro)原代培养原代培养肿瘤瘤细胞胞:从从肿瘤瘤组织中分离得到的中分离得到的细胞在体外成功地胞在体外成功地进行行培养称培养称为原代培养原代培养(primaryculture)肿瘤瘤细胞系胞系:原代培养原代培养肿瘤瘤细胞能胞能连续传代（代（约710天天传代一次）代一次）半年以上半年以上,生生长稳定定,并能保持并能保持肿瘤瘤细胞的特性，胞的特性，称称为肿瘤瘤细胞系胞系(cellline)肿瘤瘤细胞株胞株:细胞系胞系经细胞克隆或其它方法胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性得具有某种生物学特性的的纯谱系的系的细胞称胞称为肿瘤瘤细胞株胞株(cellstrain),细胞具有胞具有相同的基因型和表型相同的基因型和表型(单克隆克隆)4.肿瘤瘤细胞株的建立：胞株的建立：1、直接从人的直接从人的肿瘤或瘤或动物的自物的自发及及诱发肿瘤瘤组织分离培养分离培养建系和建株建系和建株;(从自从自发或或诱发瘤瘤)2、从人或、从人或动物的移植物的移植肿瘤瘤(如人如人肿瘤裸鼠移植瘤瘤裸鼠移植瘤)组织分离分离培养建系及建株培养建系及建株;(从移植瘤从移植瘤)3、用化学或生物、用化学或生物(病毒病毒)方法在体外方法在体外转化正常的人或化正常的人或动物的物的细胞株而胞株而获得得肿瘤瘤细胞株。胞株。(体外体外转化化)5.肿瘤瘤细胞株的胞株的鉴定定：1.有关的原始有关的原始资料料,包括供瘤病人的包括供瘤病人的姓名姓名、年年龄、性性别、病病历号号、临床床诊断断（TNM）、活活检病病理理诊断断,手手术切切除除日日期期、最最后后病病理理诊断断等等2.形形态学学观察察:普普通通倒倒置置相相差差光光镜:活活细胞胞的的形形态,细胞胞间桥,分分泌泌颗粒粒,重重叠叠生生长,Giemsa染色或染色或H.E.染色的光染色的光镜形形态与与肿瘤瘤细胞的生胞的生长条件有一定关系条件有一定关系:HeLa:高高浓度血清度血清长梭形梭形;低低浓度血清度血清圆形形细胞胞,排列如排列如鹅卵石路面卵石路面;透射和透射和扫描描电镜3D组织结构构6.3.核型及染色体核型及染色体观察察:整倍体整倍体,异倍体异倍体,染色体畸染色体畸变、标记染色体染色体,染色体分染色体分带分析分析,相隔一定相隔一定时间重复重复观察数次察数次4.生生长特性特性:分裂指数分裂指数（3H-thymidine或或5-BrdU的的labelingindex）、）、生生长曲曲线、细胞群体倍增胞群体倍增时间、集落形成或集落形成或贴壁率（壁率（platingefficiency）半固体培养介半固体培养介质中的集落形成率中的集落形成率5.组织特性的特性的鉴定定:免疫免疫细胞化学方法胞化学方法7.上皮性上皮性肿瘤瘤标志志:CK、上皮膜抗原（、上皮膜抗原（EMA）、）、癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原淋巴瘤抗原标志志:人白人白细胞分化抗原簇（胞分化抗原簇（CD）,有有274个以上个以上,T淋巴淋巴细胞胞:UCHL-1(CD45RO),B淋巴淋巴细胞胞:L26（CD20）,软组织肿瘤瘤标志：志：波形蛋白（波形蛋白（Vm）肌源性：肌源性：结蛋白（蛋白（Dm）、肌）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白蛋白神神经源性：源性：神神经微微丝（NF）、）、S-100蛋白、蛋白、Leu-7、神神经元特异性元特异性烯醇化醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性：胞源性：-1抗胰蛋白抗胰蛋白酶、-1抗糜蛋白抗糜蛋白酶、CD68血管源性：血管源性：八因子相关抗原、八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素豆凝集素(UL)基膜源性：基膜源性：纤连蛋白（蛋白（FN）和）和层粘粘连蛋白（蛋白（LN）体体外外培培养养时肿瘤瘤细胞胞株株有有可可能能会会失失去去原原本本表表达达的的某某些些组织抗抗原原,抗抗原原标志志要要多多选用几种抗体用几种抗体,以减少假阴性以减少假阴性结果果;8.6.其他特性：其他特性：(a)分泌激素和异位激素分泌激素和异位激素:绒毛膜癌毛膜癌HCG垂体瘤垂体瘤生生长激素激素肺燕麦肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌胞癌和一些甲状腺癌ACTH人肺巨人肺巨细胞癌胞癌细胞株（胞株（PLA-801）促性腺激素促性腺激素肝癌肝癌HCG(b)肿瘤瘤细胞的受体表达胞的受体表达:ERPRAR(c)酶及同工及同工酶活性活性:酶活性保持活性保持(HTC酪氨酸氨基酪氨酸氨基转移移酶)、变化化诱导剂糖皮糖皮质激素、多激素、多肽激素激素改改变培养条件：培养条件：谷氨酸替代谷氨谷氨酸替代谷氨酰胺胺脑星形胶星形胶质细胞谷氨胞谷氨酰合成合成酶活性活性增增7倍倍左右左右特异的同工特异的同工酶谱：绒癌癌T3M-3表达胎表达胎盘性碱性磷酸性碱性磷酸酶9.(d)癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高高转移人卵巢移人卵巢细胞系胞系HO-8910PM表达：表达：p53p16bcl-2nm-23CD44v6c-erbB-2EGFR等基因的蛋白等基因的蛋白产物物不表达：不表达：Bax基因的蛋白基因的蛋白产物物10.7.细胞株交叉胞株交叉污染的染的检测：细胞胞遗传学方法：学方法：染色体分析染色体分析特异的染色体特异的染色体标志探志探针作作FISHG带核型分析核型分析鉴别同种同种肿瘤瘤细胞胞Q带分析分析检测人人Y染色体染色体免疫学方法：免疫学方法：HLA或或动物的物的组织相容性抗原的相容性抗原的测定定生化方法：生化方法：同工同工酶谱或其它生化指或其它生化指标11.8.微生物微生物污染的染的检测：细菌：菌：培液混培液混浊，高倍，高倍镜下下隐约可可见均匀散在均匀散在细小菌体小菌体真菌：真菌：培液混培液混浊，高倍，高倍镜下可下可见菌菌丝或或孢子子病毒：病毒：病毒核酸和蛋白病毒核酸和蛋白产物物支原体：支原体：以核酸（以核酸（DNA）荧光染色即光染色即H-stain(Hoechst33258，即二苯并咪即二苯并咪唑染色染色)较为常用常用,356nm光的激光的激发下下可可发出出458nm的的强荧光光,12.体外正常体外正常细胞胞恶性性转化的化的鉴定定正常正常细胞体外胞体外恶性性转化的化的鉴定指定指标(14项指指标)（第二届全国（第二届全国细胞和胞和组织培养培养专题讨论会通会通过）核型分析出核型分析出现非整倍体非整倍体能在能在软琼脂培养基中增殖并形成集落脂培养基中增殖并形成集落异种异种动物接种能生成物接种能生成肿瘤瘤端粒保持不端粒保持不变或延或延长以及端粒以及端粒酶活性的增高活性的增高13.指指标正常正常细胞胞转化的化的纤维母母细胞胞转化的上皮化的上皮细胞胞形形态伸伸展展良良好好,折折光光较弱弱;核核质比比小小,梭梭形形,伸伸展展较差差,折折光光较强;核核质比比大大,与与正正常常细胞胞之之间差差别不不如如纤维母母细胞胞胞胞质嗜碱性弱嗜碱性弱;核仁核仁较小小较少少;胞胞质嗜碱性嗜碱性强,核仁核仁较大大较多多;多核巨多核巨细胞胞大大;多形性多形性较常常见多核巨多核巨细胞胞较少少较多多粘附性粘附性细胞胞间粘附性粘附性较强,紧贴瓶壁生瓶壁生长粘附性差粘附性差,易脱落易脱落差差别不明不明显生生长特性特性排列有方向性排列有方向性,单层生生长,存在密度存在密度方向性消失方向性消失,多多层重叠重叠,密度依密度依赖性抑制消失性抑制消失差差别不明不明显,某些某些细胞株呈重叠生胞株呈重叠生长依依赖性抑制性抑制对血清的依血清的依赖较高高较低低差差别不明不明显扫描描电镜观察察微微绒毛少毛少微微绒毛丰富毛丰富微微绒毛不毛不稳定定,有有时增多增多植物凝集素引起的凝集植物凝集素引起的凝集弱弱较弱弱较强细胞表面的糖蛋白和糖脂胞表面的糖蛋白和糖脂正常正常糖基化不完全糖基化不完全糖基化不完全糖基化不完全纤维连接蛋白接蛋白正常存在正常存在减少或消失减少或消失纤溶溶酶原激活原激活酶较低低增高增高不不稳定定,某些株增高某些株增高胞胞质中微中微丝微管的排列微管的排列规则紊乱紊乱不不稳定定胞胞质cAMP浓度度较高高较低低核型核型二倍体二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体非整倍体琼脂培养脂培养不生不生长生生长生生长接种异种易感接种异种易感动物物不不长肿瘤瘤长肿瘤瘤长肿瘤瘤14.世界各国的世界各国的细胞胞库（cellbank）及索引）及索引美国美国美国典型培养美国典型培养细胞胞库（AmericanTypeCultureCollection,即即ATCC,Rockville,MD）人与人与动物物细胞培养目胞培养目录（CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures,NavalBiosciencesLaboratory,CellCultureDepartment,NavalSupplyCenter,Oakland,CA)人基因突人基因突变细胞及老年胞及老年细胞培养胞培养库（HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCell,CultureRepositories,InstituteforMedicalResearch,Camden,NJ)欧洲欧洲真核真核细胞培养胞培养库(CulturedeCellulesEucaryotes,RepertoiredesUtilisateurs.,M.Adophe,D.Gourdji,A.Tixier-Vidal,R.Robineaux,InsermPublications,101RuedeTobiac,75654Paris,Cedex13医学病毒学系（医学病毒学系（DepartmentofMedicalVirology,InstitutedePasteur,Paris)欧洲欧洲动物物细胞培养胞培养库（EuropeanCollectionforAnimalCellCultures,即即ECACC,PHLS/CAMR,Porton,Salisbury,England)欧欧洲洲人人类基基因因突突变细胞胞库(European Human GeneticMutant Cell Bank,Department of ClinicalGenetics,ErasmusUniversity,Rotterdam)日本日本癌癌细胞系胞系库(CollectionofCancerCelllines,NationalInstituteofHygenicSciences,Tokyo)普通普通细胞胞库(GeneralCellBank,InstituteofPhysicalandChemicalResearchofRIKEN,Saitama)FlowLaboratories;GIBCO15.特殊表型特殊表型肿瘤瘤细胞系（株）：胞系（株）：高高转移移人肝人肝细胞性肝癌胞性肝癌细胞株胞株MHCC97人黑色素瘤人黑色素瘤细胞株胞株MV3、卵巢癌卵巢癌细胞株胞株HO-8910PM、肺巨肺巨细胞癌胞癌细胞株胞株PGBE1高度耐高度耐药人人红白血病白血病细胞株胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增阿霉素的抗性增114.7倍倍分泌分泌产生激素、蛋白、生激素、蛋白、酶或一些因子或一些因子人肺小人肺小细胞癌胞癌细胞株胞株LU-165抗利尿激素抗利尿激素;人肺腺癌人肺腺癌细胞株胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白抗胰蛋白酶人人红白血病白血病细胞株胞株K562高表达端粒高表达端粒酶16.体内研究体内研究(InVivo)肿瘤瘤动物模型：物模型：自自发性性肿瘤瘤诱发性性肿瘤瘤移植性移植性肿瘤瘤.17.一、自一、自发性性肿瘤瘤种系种系：大鼠的自大鼠的自发肿瘤不如小鼠多瘤不如小鼠多见，大，大动物更物更为少少见Sinclair猪到一猪到一岁时有有85%可可发生生恶性黑色素瘤性黑色素瘤品系品系：C3H小鼠小鼠乳腺癌乳腺癌发病率病率为97%BALB/c乳腺癌乳腺癌发病率低病率低AKR小鼠小鼠淋巴淋巴细胞性白血病胞性白血病发病率病率为70%90%近交系近交系SJL/J小鼠小鼠淋巴瘤淋巴瘤(何杰金病何杰金病)自自发率高达率高达91%缺点缺点：发病病迟,发病病时期不集中期不集中,发病率也不病率也不稳定定18.二、二、诱发性性肿瘤瘤优点：点：发生率、生率、发病病时间、发生部位及生部位及组织学学类型均易控制型均易控制实验结果重复性相果重复性相对较好好1.化学化学诱癌癌动物物肿瘤模型瘤模型1775年英国医年英国医师Pott扫烟囱烟囱阴囊癌阴囊癌1914年年,日本学者日本学者山极和市川山极和市川煤焦油煤焦油皮肤癌皮肤癌1934年年Yashida用用邻氨基偶氮甲苯氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功大鼠肝癌成功我国从我国从1960年代开始年代开始进行化学行化学诱癌癌动物模型的研究物模型的研究1956年年亚硝胺硝胺和和1961年年黄曲霉毒素黄曲霉毒素的致癌作用相的致癌作用相继被被发现19.(1)化学致癌物化学致癌物诱发时间相相对较短短有有剂量量-效效应关系关系基因毒化学致癌物一般具有高度基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，子性，与生物大分子中富于与生物大分子中富于电子的子的亲核残基相核残基相结合合,影响影响硷基基对的正常配位或大分子的的正常配位或大分子的结构与功能构与功能正常正常细胞的癌胞的癌变.直接致癌物和前致癌物（直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）接致癌物）20.常常见化学致癌物化学致癌物:1)多多环碳碳氢化合物化合物:25种以上种以上,以煤焦油的主要成分以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘苯并芘和和3-甲基胆蒽的致癌性最甲基胆蒽的致癌性最强2)氨基偶氮化合物氨基偶氮化合物:二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄奶油黄),3-甲基甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯二甲基氨基偶氮苯(3-Me-DAB)3)芳香胺芳香胺类:苯胺印染工厂苯胺印染工厂吸入乙吸入乙萘胺在肝胺在肝变为氨基苯氨基苯经肾排出排出联苯胺苯胺膀胱癌膀胱癌2-乙乙酰氨基芴氨基芴(2-AAF)4)亚硝胺硝胺类:亚硝酸硝酸盐+二二级胺胺亚硝胺硝胺类化合物化合物强致癌物致癌物致癌致癌谱甚广甚广不同分子的不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官硝胺化合物仍有一定的器官亲和性和性对称衍生物如二称衍生物如二烷基基亚硝胺硝胺肝癌肝癌不不对称的称的亚硝胺硝胺食管癌食管癌21.5)霉菌毒素霉菌毒素:种种类较多多首推首推黄曲霉毒素黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉存在于霉变的花生、的花生、玉米及谷物中玉米及谷物中,6)金属元素金属元素:砷、砷、铬、镍、肺癌肺癌镉前列腺癌前列腺癌.(2)影响化学致癌的因素影响化学致癌的因素22.1)动物方面物方面品系品系:诱发肝癌肝癌时：F-344大鼠大鼠对DEN和和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高的敏感性要比其它品系的大鼠高诱发皮肤皮肤肿瘤：瘤：BALB/c和和SENCAR品系小鼠品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性的敏感性大大高于大大高于Swiss品系小品系小鼠鼠性性别:2AAF诱发肝癌：肝癌：小鼠小鼠60%发生肝癌生肝癌,小鼠不敏感小鼠不敏感.F-344大鼠大鼠,比比更敏感更敏感年年龄:一般而言一般而言,动物年物年龄越小越小,对化学致癌物越敏感化学致癌物越敏感,敏感性：敏感性：胎鼠胎鼠新生鼠新生鼠成年鼠成年鼠23.2)化学致癌物方面化学致癌物方面剂量量阈值:启启动因子（因子（initiator）不表）不表现明明显的的剂量量阈值促癌因子（促癌因子（promotor）则有有剂量量阈值一般的化学致癌物往往兼有启一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用和促癌的作用,因此仍可表因此仍可表现有有剂量量阈值如如3-Me-DAB(60ppm)致癌致癌强度度:诱发大鼠肝癌大鼠肝癌总剂量量:DAB为1000mg3-Me-DAB为600mg,2-AAF为250mg,DMN只需只需100mg;24.诱癌潜伏期癌潜伏期:诱发肝癌：肝癌：AFB1需需时约1年年,3-Me-DAB与与2-AAF约半年左右半年左右,DEN一般只需一般只需3个月个月;诱癌靶器官癌靶器官:诱癌癌谱：相：相对专一，如一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌一般只引起肝癌,较广，如广，如亚硝胺硝胺类可可诱发多器官多器官肿瘤瘤;化学致癌物的相互作用化学致癌物的相互作用:多数多数协同作用而加速致癌同作用而加速致癌,少数少数会会产生拮抗作用生拮抗作用.有的化学物有的化学物质单独使用独使用时本身不致癌本身不致癌,但可增但可增强致癌物作用（促癌物）致癌物作用（促癌物）25.3)3)诱癌方案（癌方案（carcinogenicregimen）和方法）和方法半年后半年后12周后周后喂正常喂正常饲料料(代表代表1周周)喂含喂含0.06%3Me-DAB的的饲料料喂含喂含0.02%2-AAF的的饲料料部分肝切除部分肝切除26.苯并蒽苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤直接涂擦皮肤注射至皮下注射至皮下产生皮肤癌生皮肤癌产生生纤维肉瘤肉瘤27.非基因毒致癌物非基因毒致癌物(non-genotoxiccarcinogen)美国公布的美国公布的301种化合物中种化合物中,162种可致鼠种可致鼠类肿瘤瘤其中其中36%不引起不引起细胞胞DNA的改的改变44%不引起不引起细胞突胞突变致癌机制？致癌机制？促促进细胞增殖？胞增殖？抑制抑制细胞凋亡？胞凋亡？其它未知？其它未知？28.2生物因子生物因子诱发动物物肿瘤模型瘤模型(1)病毒病毒诱发动物物肿瘤模型瘤模型1908年年Ellermann和和Bang白血病白血病鸡的无的无细胞胞滤液液诱发鸡白血病白血病获成功成功白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌癌等等,与与病毒感染病毒感染有关有关1)DNA病毒病毒多瘤病毒多瘤病毒(PyV)疱疹病毒疱疹病毒(herpesvirussylvilagas)2)RNA病毒病毒急性急性RNA肿瘤病毒：瘤病毒：潜伏期潜伏期较短短(34周周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、个个别小鼠白血病病毒小鼠白血病病毒(如如Abl-MuLV)都属于本都属于本组.该组病毒基因病毒基因组结构常有缺陷构常有缺陷,需需辅助病毒助病毒协助才能复制助才能复制慢性慢性RNA肿瘤病毒：瘤病毒：潜伏期潜伏期较长(412月月)，大部分，大部分动物白血病病毒属于本物白血病病毒属于本组29.（2）其它生物因子）其它生物因子诱发的的动物物肿瘤模型瘤模型幽幽门螺杆菌感染螺杆菌感染SPF级的的BALB/c小鼠小鼠,22月以后月以后,38%的的实验小鼠胃有淋巴小鼠胃有淋巴滤泡增生泡增生,25%的小鼠胃出的小鼠胃出现形形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变（B细胞淋巴瘤）胞淋巴瘤）30.3.转基因基因动物物肿瘤模型瘤模型Stewart等等获得得13个个MMTV-LTR/myc融合基因的融合基因的转基因小鼠系基因小鼠系,其中两株其中两株c-myc启启动子子为MMTV-LTR启启动子中子中糖皮糖皮质激素受体激素受体反反应元件元件所取代所取代,在在早期妊娠早期妊娠时即即发生自生自发性乳腺癌性乳腺癌。Chisari等等HHBV的的S基因、病毒增基因、病毒增强子和子和X基因基因转基因小鼠基因小鼠,HBsAg的的积聚聚引起内引起内质网明网明显扩张,出出现肝肝细胞毛玻璃胞毛玻璃样改改变,100%小鼠小鼠发生生肝肝脏肿瘤瘤X基因和病毒增基因和病毒增强子的子的质粒粒X基因基因转基因小鼠基因小鼠,21月月龄时,两个品系两个品系转基因小鼠基因小鼠肝肝肿瘤瘤发生率分生率分别为75%82.8%31.三、移植性三、移植性肿瘤瘤可移植瘤株可移植瘤株：将一种将一种动物物肿瘤移植到同系同种或异种瘤移植到同系同种或异种动物物,经传代（代（20代）代）,组织形形态特征逐特征逐渐稳定，即成定，即成为同同种种或异种或异种动物的可移植瘤株。物的可移植瘤株。移植瘤来源：移植瘤来源：动物自物自发性性肿瘤或瘤或诱发性性肿瘤瘤我国用我国用615近交系小鼠的自近交系小鼠的自发瘤瘤建立了：建立了：肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株用用诱发瘤瘤建立了：建立了：小鼠小鼠宫颈癌（癌（U27及及U14）小鼠前胃癌（小鼠前胃癌（Fc）肝肝细胞癌等移植瘤株。胞癌等移植瘤株。32.近交系近交系动物的物的应用用：1962年年,苏格格兰医医师Dssacson和和Cattanach发现（裸小鼠）（裸小鼠）*移植性人移植性人肿瘤裸鼠模型广泛瘤裸鼠模型广泛应用用1、免疫缺陷、免疫缺陷动物物(1)T细胞免疫功能缺陷胞免疫功能缺陷动物物裸小鼠裸小鼠：*先天性先天性胸腺胸腺发育不良育不良(妊娠妊娠1415天可天可见少量胸腺少量胸腺痕迹痕迹,并非全无胸腺并非全无胸腺)*胸腺依胸腺依赖性性T细胞胞明明显减少或缺乏减少或缺乏,*B细胞胞仍然存在仍然存在,但功能低下但功能低下,免疫球蛋白以免疫球蛋白以IgM为主主,*NK细胞胞有有较强活力。活力。纯合子的裸大鼠合子的裸大鼠：基因符号：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似。特征与裸小鼠相似无胸腺大鼠无胸腺大鼠33.(2)B细胞免疫功能缺陷胞免疫功能缺陷动物物B细胞胞功能衰退功能衰退,血血浆IgM、IgG低下低下,T细胞功能尚属正常胞功能尚属正常CBA/N系小鼠系小鼠Arabian和和Quarter马(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物物CBA/NNU小鼠小鼠T、B淋巴淋巴细胞胞功能均缺陷功能均缺陷;严重重联合免疫缺陷小鼠（合免疫缺陷小鼠（SCID）：突：突变基因基因scid位于第位于第16对染色体染色体纯合子小鼠合子小鼠T、B淋巴淋巴细胞胞极度低下极度低下,NK细胞和抗原胞和抗原传递细胞功能尚正常胞功能尚正常先天性先天性联合免疫缺陷型小鼠：合免疫缺陷型小鼠：NK细胞、胞、T、B细胞胞功能功能联合缺陷裸小鼠：合缺陷裸小鼠：缺点：缺点：*需在需在germ-free或或SPF条件下条件下饲养，养，较苛刻苛刻*平均寿命平均寿命仅1430d。34.2、人、人肿瘤免疫缺陷瘤免疫缺陷动物模型物模型移植成功率移植成功率:取决于取决于移植方法移植方法：人癌人癌组织直接移植的成功率平均直接移植的成功率平均为30%人癌人癌细胞株胞株为6070%肿瘤本身瘤本身：成功率最高成功率最高结肠癌、胃癌、黑色素瘤癌、胃癌、黑色素瘤;其次其次胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等癌、食管癌等;较低低前列腺癌、乳腺浸前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网癌、淋巴网织系系统肿瘤和白血病瘤和白血病裸小鼠品系裸小鼠品系：人前列腺癌人前列腺癌BALB/c成功率成功率仅2%（3/150）NMRI裸小鼠可达裸小鼠可达35%（6/16）其它其它：接种部位接种部位宿主宿主遗传背景背景年年龄和建康状况等和建康状况等35.(1)人人组织裸鼠裸鼠诱癌癌模型模型诱发鼻咽癌鼻咽癌青少年慢性鼻咽增殖体炎青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活鼻咽活检或或刮除刮除组织移植于移植于NC系裸小鼠系裸小鼠二二亚硝基硝基哌嗪（NDP）为致癌致癌剂鼻咽上皮增生鼻咽上皮增生巴豆油巴豆油A因子因子（TPA）为促癌促癌剂乳乳头状增生、不典型增生状增生、不典型增生原位癌原位癌诱发肺癌肺癌裸鼠体内人裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也气管、支气管培养成功也为用人材料用人材料诱发肺癌的肺癌的实验奠定了基奠定了基础36.(2)人人肿瘤裸鼠移植模型瘤裸鼠移植模型*1969年丹麦的年丹麦的Ryggard人人结肠癌移植于裸小鼠癌移植于裸小鼠*100余种人余种人类恶性性肿瘤裸小鼠移植模型：瘤裸小鼠移植模型：癌癌肿肝、肺、胃、肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、食管、胰腺、乳腺、前列腺、鼻咽、前列腺、鼻咽、淋巴造血系淋巴造血系统肿瘤瘤软组织肿瘤瘤其它其它黑色素瘤、黑色素瘤、视网膜母网膜母细胞瘤胞瘤*1978年年Festing首次首次进行裸大鼠人癌异种移植行裸大鼠人癌异种移植*1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与与LTMR2两株两株37.(3)人人肿瘤瘤转移裸鼠模型移裸鼠模型我国始于我国始于80年代中期年代中期肺癌肺癌、肝癌肝癌转移及移及胃癌肝胃癌肝转移移和和淋巴道淋巴道转移移等等1)人肺癌高人肺癌高转移裸小鼠模型移裸小鼠模型吴秉吴秉铨等将等将6株人肺癌株人肺癌细胞系移植胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠裸小鼠其中一株肺巨其中一株肺巨细胞癌胞癌细胞系移植建成高胞系移植建成高转移模型移模型,定名定名为PG带瘤瘤存活存活30天以上裸小鼠天以上裸小鼠中中淋巴淋巴结转移移(29/30)肺肺转移移(26/30)传17代后代后,瘤瘤组织再移植裸小鼠再移植裸小鼠(存活存活30天天)淋巴淋巴结转移移(12/12)肺肺转移移(9/12)转移率达移率达100%2)人肝癌高人肝癌高转移裸小鼠模型移裸小鼠模型孙肪肪宪,汤钊猷等用猷等用30例人肝癌例人肝癌组织直接移植于直接移植于46周周龄的的BALB/cA,nu/nu裸小鼠裸小鼠,移植移植部位部位在小鼠在小鼠肝肝实质内或内或肝包膜下肝包膜下其中一例其中一例39岁男性男性(巨巨块型肝型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴胞癌伴肝内播散和淋巴结转移移)其移植瘤育成其移植瘤育成人肝癌高人肝癌高转移裸鼠模型移裸鼠模型,定名定名为LCI-D-20鼠鼠间连续传代代(16代代)成功率成功率100%,间期期为20天天肺、淋巴肺、淋巴结及肝内及肝内转移移(72/72),腹腔种植腹腔种植转移移(50/72),转移率达移率达100%38.3)其它其它胃癌肝胃癌肝转移移杨善民等用善民等用人低分化人低分化胃粘液腺癌胃粘液腺癌细胞系胞系MGC80-3在在BALB/c裸小鼠建成移植瘤后裸小鼠建成移植瘤后再用再用移植瘤移植瘤单细胞胞悬液液接种于裸小鼠接种于裸小鼠脾包膜脾包膜下下肝内胃癌肝内胃癌转移移率达率达60%用用CCl4处理裸小鼠理裸小鼠,肝内胃癌肝内胃癌转移率可达移率可达100%,其它其它脏器器则未未见转移移淋巴淋巴结转移移李斯德等将人李斯德等将人小小细胞癌胞癌NCI-H128细胞系接种裸小鼠胞系接种裸小鼠腹股沟、腋腹股沟、腋窝和和颌下淋巴下淋巴结出出现转移移淋巴淋巴结转移率移率达达100%39.3应用用肿瘤的生物学特性瘤的生物学特性浸浸润转移移临床治床治疗基因治基因治疗导向治向治疗药敏敏测定法定法（SRC）实验可可评价率价率为93%新抗癌新抗癌药物开物开发筛选40.41.MolecularOncologySomeMolecularMethodologyinTumorResearch42.一、基因一、基因变异的异的诊断断基因表达异常基因表达异常肿瘤瘤基因突基因突变：转位，重排位，重排Southernblot，PCR点突点突变DGGE硷基缺失基缺失CDGESSCP基因基因丢失：失：SSCPMicrosatellitesanalysisDGGE=DenaturingGradientGelElectrophoresisCDGE=ConstantDenaturingGelElectrophoresisSSCP=SingleStrandConformationPolymorphism43.PCR-SSCP:year1989,OritaMGenePCRHomozygoteHetrozygoteHeating(50)for10min+formamideNondenaturingPAGE(300V,5h,silverstaining)44.PCR-SSCP灵敏度高，一个灵敏度高，一个硷基的改基的改变可在可在电泳速度上反映出来泳速度上反映出来但但DNA片段的大小与灵敏度有关片段的大小与灵敏度有关100-300bp突突变检出率出率97%300-500bp检出率出率67%以以200bp左右左右为佳佳45.PCR-SSCP的主要步的主要步骤：1.DNA模板制模板制备（从石蜡（从石蜡组织中提取）中提取）脱蜡：少脱蜡：少许石蜡石蜡组织放入放入Eppendorf管管+1ml二甲苯二甲苯65，5分分钟离心，离心，5分分钟，弃上清，弃上清重复一次重复一次1mlEtOH,振振摇后离心后离心5分分钟，弃上清，弃上清1mlEtOH(70%),振振摇后离心后离心5分分钟，弃上清，弃上清真空离心真空离心5分分钟，使干燥，使干燥46.消化：消化：180m mlpH8.0TE+20m mlbuffer+10m mlproteinaseK(20mg/ml)55,3-5h加加50m mlChelex-100(25%水溶液水溶液)55,1h100,10minspin,3min提提纯DNA：上清上清+200m mlphenol,剧烈振烈振摇离心，离心，3min上清上清+phenol/choroform,振振摇离心，离心，3min水相水相+25m mlNaOAc3M,1m mlglycogen,750m mlEtOH(pure)-20,overnightspin15min,at4pelletswashedwithEtOH70%spin,pelletsresuspendedin100-200m mlTE,pH847.2.RunPCR注意：注意：PCR产物最好在物最好在200bp左右左右琼脂糖脂糖电泳条泳条带清晰清晰3.PCR产物物run非非变性性PAGE制胶（制胶（36%MDE胶，胶，or6%polyacrylamide）稀稀释样品（品（1m mlPCR产物物+4m ml去离子水）去离子水）alkalinedenature,(+1m mlNaOH,4m ml去离子水）去离子水）50水浴水浴10min后后+stopsolution2m ml)12m ml/well20恒温，恒温，300伏恒伏恒压下下电泳泳5hAlkalinestocksolution:0.5MNaOH+10mMEDTAStopsolution:1mlformamide(99%pure)+20m ml0.5MEDTA(pH8.0)+50m ml1%bromophenol+25m ml1%xylenecyanol48.4.胶染色胶染色PAGE胶作胶作记号（左下角切去小号（左下角切去小）入）入10%醋酸固定醋酸固定20min胶用去离子水洗三次，每次胶用去离子水洗三次，每次2min胶入硝酸胶入硝酸银溶液反溶液反应30min胶用去离子水洗一次，胶用去离子水洗一次，约半分半分钟胶入胶入还原液原液还原原显色（色（时间依需要而定）依需要而定）胶入胶入10%醋酸醋酸终止反止反应，约5分分钟胶在胶在80下真空干燥下真空干燥2小小时49.P53基因基因exon5突突变（PCR-SSCP）NTLNTL50.PCR-SSCP的的应用：用：1.经PCR-SSCP确定确定DNA片段有突片段有突变，该片段片段经测序可确序可确定突定突变的形式和定位，可避免因的形式和定位，可避免因测序或序或PCR反反应出出现的碱的碱基配基配对差差错造成的假阳性造成的假阳性2.在无非特异性在无非特异性电泳条泳条带情况下，可以初步确定有无基因的情况下，可以初步确定有无基因的杂合性合性丢失（失（LossofHetrozygote,LOH)51.二、二、检测基因的基因的丢失和失和扩增增比比较基因基因组杂交交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技分子生物学技术与与细胞胞遗传学方法相学方法相结合合优点：点：1.新新鲜材料和福材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可林固定石蜡包埋材料均可进行行CGH研究研究2.被被测样品只需数品只需数m mg甚至不到甚至不到1m mg的的DNA52.R/G低度扩增高度扩增丢失不同不同荧光（光（红/绿）标记基因基因组DNA片段片段（500-2000bp）人人Cot-1DNA对正常人染色体进行原位分子杂交被测DNA参照DNA退火及退火及预杂交交53.石蜡包埋材料提取的石蜡包埋材料提取的DNA质量量较差，可用差，可用变性引物性引物对所提所提取的基因取的基因组DNA进行整体行整体扩增增DegenerationOligonucleotidePrimedPCR(DOP-PCR)Firststep:Primer:5CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(DOP)酶：消除：消除35外切外切酶活性的活性的T7噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶条件：条件：宽松条件（松条件（Lowstringency)30/5min37/2min96/2minfor5cycles54.Secondstep:Template:theproductofthefirststeprunningPrimer:DOP酶：Taq聚合聚合酶条件：条件：95/5min后后进入循入循环94/1min56/1min72/2minfor35cycles72/5min用用DOP-PCR只需石蜡包埋材料只需石蜡包埋材料DNA50pg(相当于相当于5-10个个细胞）即可胞）即可进行行CGH分析，而常分析，而常规方法需至少方法需至少200个个细胞，两胞，两者者CGH的的图形（形（profile)是相同的是相同的切片染色切片染色不能用不能用HE，而用甲基，而用甲基绿55.CGH的的应用：用：1.为搜搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤瘤细胞染色体某一位置上胞染色体某一位置上DNA序列拷序列拷贝数增加，数增加，往往提示往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增增肿瘤瘤细胞染色体某一位置上胞染色体某一位置上DNA序列拷序列拷贝数减少数减少或缺失，提示或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌位置可能包含已知或未知的抑癌基因基因丢失失CGH发现MYCN，MET与胃癌相关与胃癌相关56.2.区分良区分良恶性病性病变，临床上估床上估计预后后16例前列腺癌例前列腺癌CGH显示染色体异常占示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性例良性前列腺增生全部阴性67肝肝细胞癌胞癌CGH显示示:1q,8q,20q,17q4q,8p,13q,16q12例癌周肝硬化例癌周肝硬化组织：阴性：阴性53例淋巴例淋巴结阴性乳腺癌：阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，异常，预后差后差57.三、三、检测细胞基因表达胞基因表达谱的差异的差异消减消减杂交交抑制消减抑制消减杂交交cDNA代表性差异分析代表性差异分析SAGEDNAmicroarraymRNA差异差异显示（示（mRNAdifferentialdisplay)RT-PCR+测序序电泳，泳，经典，可重复性典，可重复性可展示可展示10000-15000种种mRNA的表达的表达58.实质是是RT-PCR引物引物设计很有特点很有特点锚定引物：定引物：12个个T可可结合合mRNA的的polyA上上T12MNM=A，G，CN=A，G，C，T据排列据排列组合，一种合，一种T12MN可与可与1/12的的mRNA结合合随机引物：可在与随机引物：可在与polyA末端不同距离的多个位置上末端不同距离的多个位置上结合合差异差异显示的示的产物是物是长度不一的度不一的cDNA片段的混合物片段的混合物59.差异差异显示的技示的技术路路线提取高提取高质量的量的总RNA，DNA酶处理理用用锚定引物定引物T12MN进行逆行逆转录用相同的用相同的T12MN引物及随机引物引物及随机引物进行行PCR扩增增（同（同时用同位素用同位素对PCR产物物进行行标记）测序胶序胶电泳分离泳分离PCR产物物切下差异表达的条切下差异表达的条带，用相同引物，用相同引物进行二次行二次PCR扩增增PCR产物制成探物制成探针Northernblot验证60.*相相对较敏感：敏感：200个个细胞的胞的总RNA足足够进行差异分析行差异分析*低丰度低丰度mRNA的的显示不理想示不理想对策：策：（1）先通