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第八章 种子健康检验
第一节 概况
一、种子健康测定的目的
1、有关定义
种子健康测定：测定种子是否携带有病原菌(如真菌、细菌及病毒)、有害的动物(如线虫及害虫)等健康状况。即对种子所携带病虫害种类及数量进行检测。
种传病害：在病毒侵染循环中的某一阶段和种子联系在一起，其病原物附着、寄生或存在于种子表面和内部，或混杂于种子中间，主要通过种子携带而传播的一类植物病害。
种子害虫：在种子田间生长和贮藏期间，感染和危害种子的害虫。
2、种子健康测定的目的
① 检测检疫性传染病害。
② 确定种子批的使用价值。
③ 评定种子批是否需要经过种子处理，以及处理后的效果。
④ 为调查或研究目的而评估某种传染病的流行情况。
⑤ 探明发芽率低的原因，弥补发芽试验的不足。
二、种子健康检验的内容
种子健康检验包括田间检验和室内检验两部分。
田间检验是根据病虫害的发生规率，在一定生长时期进行检验。作物在田间生长时期，病虫害表现明显，容易进行检查，检查主要依靠肉眼检验。尽管比较粗放，但非常重要，因为有些带病种子在室内很难加以鉴定。
室内检验是贮藏、调种和引种过程中进行病虫害检验的主要手段。
三、种子健康测定方法的特点
1、种子健康测定方法主要有：
① 未经培养检查。包括直接检查、吸胀种子检查、洗涤检查、剖粒检查、染色检查、比重检查和X-射线检查等。
② 培养后检查包括吸水纸法、砂床法、琼脂皿法，以及噬菌体法和血清学酶联免疫吸附试验法等。
2、种子健康检测方法应达到的要求
① 使病原体容易识别；
② 结果有重演性；
③ 样品间结果有可比性；
④ 方法简单快捷且费用低；
⑤ 能适合于国际贸易检测的要求。
3、检测结果的影响因素
① 其他病原菌存在可能与被检测病原菌产生干扰；
② 检验室检测结果通常高于田间或温室的检测结果；
③ 有些病原菌对培养条件敏感；
④ 种子已经处理；
⑤ 种传病菌生活力随着长时间贮藏而衰退。
事实上，新规程上所列入的未经培养检查和培养后检查的方法都比较简单。但检查人员需要具备一定的病理学和昆虫学知识，鉴别经验；并且还需有一定的仪器设备。只要经过适当的培训，这完全是可以掌握和正确测定的。
四、种传病害的控制方法
1、确定检疫种类和划定检疫区域
通过法规，颁布检疫的种类，明确划定检疫区域和保护区域，是防止检疫对象扩展蔓延、保护农业生产安全的重要措施。
2、制定种子健康标准
制定种传病害健康标准，是控制病害发生的一项重要措施。各国根据各自的国情，在种子认证中制定了种子健康的田间标准和室内标准。种子健康测定中，有些病害在田间观察很清楚，而有些则需要室内检验。（如大麦小麦的散黑穗病在田间鉴定很容易，而检疫室检验则很困难或花费较大。）
3、种子处理
通过种子处理，可大大减轻种传病害的发生。如果通过种子健康测定，了解病原菌的感染情况和程度，则可有针对性采取措施对种子进行处理，效果更为显著。
五、种子健康检验应注意的问题
1、测定方法
种子健康测定的不同方法的敏感性、重演性以及所需培训和设备要求各不相同。
选择种子健康测定方法主要取决于种子种类、病害的种类以及检测的目的。
① 对于调查、作出种子处理决定或进行田间评定等目的，只需评定种传病菌感染率即可；
② 对于检疫目的或田间发病率高的种传病菌，对种子样品的检测精度要求很高。
由于病害感染水平与田间发病程度之间没有直接联系，在许多检测方法中，一般不记录每粒种子的病原数量。
2、试验样品的量
根据测定方法，可把整个送验样品或其中一部分作为试验样品。通常试验样品不得少于400粒净种子，或从送验样品取得相当重量的种子。如有必要，需设定一定数量种子的重复。
3、结果的计算和报告
结果用供检的样品重量中被感染种子数的百分率或病原体数目表示。填报结果要填报病原菌的学名，同时说明所用的测定方法，并说明用于检查的样品或部分样品的数量。
六、种子健康测定的仪器设备
种子健康测定的仪器设备诱导病原菌生长分离和观察鉴定等方面使用。
健康测定所需的仪器设备因测定方法不同而不同，下面列出的只是最基本的仪器设备：
显微镜、培养箱、近紫外灯、冷冻冰箱、高压消毒锅、玻璃培养皿、2-4D试剂等。

第二节 检测的基本方法
一、种子健康测定的传统方法
(一)未经培养的检验(不能说明病原菌的生活力)
1．直接检查
适用于较大的病原体或杂质外表有明显症状的病害，如麦角、线虫瘿、虫瘿、黑穗病孢子、螨类等。必要时，可应用双目显微镜对试样进行检查，取出病原体或病粒，称其重量或计算其粒数。
2．吸胀种子检查
为使子实体、病症或害虫更容易观察到或促进孢子释放，把试验样品浸入水中或其他液体中，种子吸胀后检查其表面或内部，最好用双目显微镜。
3．洗涤物检查
用于检查附着在种子表面的病菌孢子或颖壳上的病原线虫。
4．剖粒检查
取试样5～l0 g(小麦等中粒种子5 g，玉米、豌豆大粒种子l0 g)用刀剖开或切开种子的被害或可疑部分，检查害虫。
5．染色检查
(1)高锰酸钾染色法
适用于检查隐蔽的米象、谷象。取试样15 g，除去杂质，倒入铜丝网中，于30℃水中浸泡l min再移入1％高锰酸钾溶液中染色l min。然后用清水洗涤，倒在白色吸水纸上用放大镜检查，挑出粒面上带有直径0.5 mm的斑点即为害虫籽粒。计算害虫含量。
(2)碘或碘化钾染色法
适用于检验豌豆象。取试样50 g，除去杂质，放入铜丝网中或用纱布包好，浸入1％碘化钾或2％碘酒溶液中1～1.5 min。取出放人0.5％的氢氧化钠溶液中，浸30 s，取出用清水洗涤15～20 s，立即检验，如豆粒表面有l~2 mm直径的圆斑点，即为豆象感染粒，计算害虫含量。
6．比重检查
取试样l00 g，除去杂质，倒入食盐饱和溶液中(含盐35.9 g溶于1000 mL水中)，搅拌10～15 min，静止1～2 min，将悬浮在上层的种子取出，结合剖粒检验，计算害虫含量。
7．软X射线检查
用于检查种子内隐匿的虫害(如蚕豆象、玉米象、麦蛾等)，通过照片或直接从荧光屏上观察。
(二)培养后的检查
试验样品经过一定时间培养后，检查种子内外部和幼苗上是否存在病原菌或其症状。常用的培养基有三类：
1.吸水纸法
吸水纸法适用于许多类型种子的种传真菌病害的检验，尤其是对于许多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的症状的发展。
吸水纸法的程序：
① 在9 cm的培养皿中放入一层滤纸和一层发芽纸，用蒸馏水湿润，倒去多于的水；
② 把种子播在纸上，盖好培养皿盖；
③ 把种子放在20 ℃下吸胀1天；
④ 在－20 ℃下冷冻过夜，杀死种子；
⑤ 在18～20 ℃和近紫外光灯（360 nm，每天12 h）光照培养5天，培养皿距光源40cm；
⑥ 立体显微镜下观察，观察时用冷光，以防止孢子结构脱水。
(1)稻瘟病(Pyriculana oryzae CaV．)
取试样400粒种子，将培养皿内的吸水纸用水湿润，每个培养皿播25粒种子，在22℃下用12 h黑暗和12 h近紫外光照的交替周期培养7 d。
也可在20 ℃下培养1天，在－20℃下培养1天，在20℃下培养5天，每天12 h黑暗和12 h交替周期的近紫外线光照（种子不会发芽，检查更容易）。
在12～50倍放大镜下检查每粒种子上的稻瘟病分生孢子。一般这种真菌会在颖片上产生小而不明显、灰色至绿色的分生孢子。这种分生孢子成束地着生在短而纤细的分生孢子梗的顶端。菌丝很少覆盖整粒种子。如有怀疑，可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。典型的分生孢子是倒梨形，透明，基部钝圆具有短齿，分两隔，通常具有尖锐的顶端，大小为(20～25)μm×（9～12）μm。
(2)水稻胡麻叶斑病(Drechslera oryzae Subram & Jain Not．)
取试样400粒种子，将培养皿里的水纸用水湿润，每个培养皿播25粒种子。在22℃下用12h黑暗和12h近紫外光照的交替周期培养7d。在12～50倍放大镜下检查每粒种子上的胡麻叶斑的分生孢子。在种皮上形成分生孢子梗和淡灰色气生幼稚丝，有时病菌会蔓延到吸水纸上。如有怀疑，可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。其分生孢子为月牙形(35～170μm ×11～17)μm，淡棕色至棕色，中部或近中部最宽，两端渐渐变细变圆。
(3)十字花科的黑胫病(Leptosphaeria maculans Ces．& de Not．)
即甘蓝黑腐病(Phomalingam Desm．)。取试样1000粒种子，每个培养皿垫入三层滤纸，加入5mL0.2％(m/V)的2，4一氯苯氧基乙酸钠盐(2，4-D)溶液，以抑制种子发芽。沥去多余的2，4-D溶液，用无菌水洗涤种子后，每个培养皿播50粒种子。在20℃用12h黑暗交替周期下培养11d。经6d后，在25倍放大镜下，检查长在种子和培养基上的甘蓝黑腐病松散生长的银白色菌丝和分生孢子器原基。经11d后，进行第二次检查感染种子及其周围的分生孢子器。记录已长有的甘蓝黑腐病分生孢子器的感染种子。
2.砂床法
适宜于某些病原体的检验。用砂时应去掉砂中杂质并通过1mm孔径的筛子，将砂粒清洗，高温烘干消毒后，放人培养皿内加水湿润，种子排列在砂床内，然后密闭保持高温，培养温度与纸床相同，待幼苗顶到培养皿盖时进行检查(约经7～10d)。
3.琼脂皿法
主要用于发育较慢的致病真菌潜伏在种子内部的病原菌，也可用于检验种子外表的病原菌。
(1)小麦颖枯病(Septoria nodorum Berk．)
先数取试样400粒，经1％(m/m)的次氯酸钠消毒l0min后，用无菌水洗涤。在含0.01%硫酸链霉素的麦芽或马铃薯左旋糖琼脂的培养基上，每个培养皿播10粒种子于琼脂表面，在20℃黑暗条件下培养7d。用肉眼检查每粒种子上缓慢长成圆形菌落的情况，该病菌菌丝体为白色或乳白色，通常稠密地覆盖着感染的种子。菌落的背面呈黄色或褐色，并随其生长颜色变深。
(2)豌豆褐斑病(Ascochyta pisi Lib)
先数取试样400粒，经1％(m/m)的次氯酸钠消毒l0min后，用无菌水洗涤。在麦芽或马铃薯葡萄糖琼脂的培养基上，每个培养皿播10粒种子于琼脂表面，在20℃黑暗条件下培养7d。用肉眼检查每粒种子外部盖满的大量白色菌丝体。对有怀疑的菌落可放在25倍放大镜下观察，根据菌落边缘的波状菌丝来确定。
(三)其他方法
大麦的散黑穗病菌可用整胚检验。
大麦散黑穗病(Ustilago muda Rostr．)：两次重复，每次重复试验样品为100～120g(根据千粒重推算含有2000～4000粒种子)。先将试验样品放人1L新配制的5％(v/v)氢氧化钠溶液中，在20℃下保持24h。用温水洗涤，使胚从软化的果皮里分离出来。收集胚在lmm网孔的筛子里，再用网孔较大的筛子收集胚乳和稃壳。将胚放入乳酸苯酚(甘油、苯酚和乳酸各1/3)和水的等量混合液里，使胚和稃壳能进一步分离。将胚移置盛有75mL清水的烧杯中，并在通风柜里，保持在沸点大约30s，以除去乳酸苯酚，并将其洗净。然后将胚移到新配制的微温甘油中，再放在16～25倍放大镜下，配置适当的台下灯光，检查大麦散黑穗病所特有的金褐色菌丝体，每次重复检查1000个胚。
测定样品中是否存在细菌、真菌或病毒等，可用生长植株进行检查，可在供检的样品中取出种子进行播种，或从样品中取得接种体，以供对健康幼苗或植株一部分进行感染试验。应注意植株从其他途径传播感染，并控制各种条件。
四、结果表示与报告
以供检的样品重量中感染种子数的百分率或病原体数目表示结果。
填报结果要填报病原菌的学名，同时说明所用的测定方法，包括所用的预措方法，并说明用于检查的样品或部分样品的数量。