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固相萃取与固相微萃取应用之原理

一 固相萃取
固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是一种基于液-固分离萃取的试样预处理技术，由柱液相色谱技术发展而来。SPE技术自70年代后期问世以来，由于其高效、可靠及耗用溶剂量少等优点，在环境等许多领域得到了快速发展。在国外已逐渐取代传统的液-液萃取而成为样品预处理的可靠而有效的方法。
SPE技术基于液相色谱的原理，可近似看作一个简单的色谱过程。吸附剂作为固定相，而流动相是萃取过程中的水样。当流动相与固定相接触时，其中的某些痕量物质（目标物）就保留在固定相中。这时用少量的选择性溶剂洗脱，即可得到富集和纯化的目标物。固相萃取可分为在线萃取线萃取前者萃取与色谱分析同步完成；而后者萃取与色谱分析分步完成，两者在原理上是一致的。
一般固相萃取的操作步骤包括固相萃取柱（即吸附剂）的选择、柱子预处理、上样、淋洗、洗脱。在实验过程中需要具体考虑的因素如下：
1）吸附剂的选择
a.传统吸附剂
在环境分析中最为常用的反相吸附剂较适用于水样中的非极性到中等极性的有机物的富集和纯化。其中有代表性的键合硅胶C18和键合硅胶C8等。该类吸附剂主要通过目标物的碳氢键同硅胶表面的官能团产生非极性的范德华力或色散力来保留目标物。
正相吸附剂包括硅酸镁、氨基、氰基、双醇基键合硅胶及氧化铝等，主要通过目标物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团的极性相互作用（氢键作用等）来保留溶于非极性介质的极性化合物。由于其特殊的作用原理，在环境分析中常用于与其它类型的吸附柱联用，吸附去除干扰物，实现样品纯化。
离子交换吸附剂则主要包括强阳离子和强阴离子交换树脂，这些树脂的骨架通常为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，主要是通过目标物的带电荷基团与键合硅胶上的带电荷基团相互静电吸引实现吸附的。
b.抗体键合吸附剂（Immunosorbents-IS）
这类新型吸附剂充分利用了生物免疫抗原-抗体之间的高灵敏性和高选择性，尤其适应于水中痕量有机物的富集与分离。其特点为，由于绝大多数有机污染物为低分子量物质，不能在动物体内引发免疫反应，所以需把待定污染物键合到牛血清白蛋白的生物大分子载体上，使其具有免疫抗原活性，再注入纯种动物体内（如兔或羊），产生抗体，经杂交瘤技术制得相应于该有机污染物的单克隆抗体。将抗体键合到反相吸附剂的硅胶表面或聚合物表面（如C18固定相），就制得了抗体键合吸附剂，可用于分离、富集特定污染物。研制开发能专门检测各种优先污染物的单克隆抗体或多克隆抗体已成为SPE技术的前沿研究领域。
抗体键合吸附剂洗脱时一般可采用20%～80%的甲醇-水溶液，该类吸附剂经冷藏保存可多次使用。进行SPE操作时应根据目标物的性质选择适合的吸附剂。表1- 1给除了常用的吸附剂类型及其相关的分离机理、洗脱剂性质和待测组分的性质。
吸附剂的用量与目标物性质（极性、挥发性）及其在水样中的浓度直接相关。通常，增加吸附剂用量可以增加对目标物的保留，可通过绘制吸附曲线确定吸附剂用量。
2）柱子预处理
活化的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并去除柱内所以杂质。通常需要两种溶剂来完成任务，第一个溶剂（初溶剂）用于净化固定相，另一个溶剂（终溶剂）用于建立一个适合的固定相环境使样品分析物得到适当的保留。每一活化溶剂用量约为1～2 mL/100 mg固定相。
终溶剂不应强于样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降低回收率。通常采用一个弱于样品溶液的溶剂不会有什么问题。制得注意的是，在活化的过程中和结束时，固定相都不能抽干，因为这将导致填料床出现裂缝，从而得到低的回收率和重新性，样品也没得到应有的净化。如果在活化过程中柱床出现裂缝，上述活化步骤都得重复。
3) 上样
将样品加入到固相萃取柱并迫使样品溶液通过固定相，使分析物和一些样本干扰物保留在固定相上。为了保留分析物，溶解样品的溶剂必须较弱。如果太强，分析物将不被保留，结果回收率将会很低，这一现象叫穿漏（breakthrough）。尽可能使用最弱的样品溶剂，可以使溶质得到最强的保留或者说最窄的谱带。只要不出现穿漏，允许采用大体积的上样量（0.5～1L）。
有时候固定样品必须用一个很强的溶剂进行萃取，这样的萃取液是不能直接上样的。所以萃取液要用一个弱溶剂稀释，以得到一个合适的溶剂总强度进行上样。例如一个土壤样品采用50%甲醇萃取，得到2 mL萃取液，用8 mL水稀释，得到10%的甲醇溶液，这样就可以直接上反相固相萃取柱而不存在穿漏问题。
4) 淋洗
分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的样品组分，淋洗溶剂的洗脱强度略强于或等于上样溶剂。淋洗溶剂必须尽量强，以洗掉尽量多的干扰组分，但不能强到可以洗脱任何一个分析物的程度。溶剂体积可为0.5～0.8 mL/100 g固定相。
淋洗时不宜使用太强溶剂，太强溶剂会将强保留杂质洗下来。使用太弱溶剂，会使淋洗体积加大。可改为强、弱溶剂混合；但混用或前后使用的溶剂必须互溶。
5）洗脱
淋洗过后，将分析物从固定相上洗脱，洗脱溶剂用量一般为0.5～0.8 mL/100 g固定相。而溶剂必须进行认真选择，溶剂太强，一些更强保留的不必要的组分将被洗出来；溶剂太弱，就需要更多的洗脱液来洗出分析物，这样固相萃取柱的浓缩功效就会削弱。
在选择洗脱溶剂时还应注意溶剂的互溶性。后流过柱床的溶剂必须与前一溶剂互溶，一个不与柱内残留溶剂互溶的溶剂是不能与固定相充分作用的，当然也不会出现适当的液固分配，导致差的回收率和不理想的净化效果。如果使用互溶的溶剂有困难，就必须干燥柱床；干燥的方法是让氮气或空气通过柱床10～15 min；或离心，干燥效果更好。
综上所述，固相萃取技术简便易行，能够明显改善色谱分离，延长色谱柱寿命，降低方法检出限。与传统的液-液萃取方法相比，SPE固相萃取显著的优势体现在：提高样品处理通量；大大减少溶剂的消耗和废物的产生；回收率高，重现性好；极低的杂质干扰；无乳化现象；多种分离模式选择；易于实现自动化。但是实验中所用的消耗品固相萃取柱价格高，实验所需费用不可忽视。

二 固相微萃取
固相微萃取（Solid-Phase Microextraction,简写为SPME）是近年来国际上兴起的一项试样分析前处理新技术。是在固相萃取基础上发展起来的，它保留了其所有的优点,摒弃了其需要柱填充物和使用溶剂进行解吸的弊病，只要一支类似进样器的固相微萃取装置即可完成全部前处理和进样工作。
固相微萃取主要针对有机物进行分析，根据有机物与溶剂之间“相似者相溶”的原则，利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出来，并逐渐富集，完成试样前处理过程。在进样过程中，利用气相色谱进样器的高温，液相色谱、毛细管电泳的流动相将吸附的组分从固定相中解吸下来，由色谱仪进行分析。
SPME萃取方式的选择主要与待测物的挥发性、基质和探针固定相涂层的性质有关。 SPME有三种不同的萃取方式：顶空萃取、空气萃取和直接萃取。对挥发性特别强的样品,可采用顶空或空气萃取，对于半挥发性和不挥发性样品来说，应采用直接萃取。
影响SPME萃取效率的因素很多，主要是对干扰分析物吸附和解析的因素进行优化。影响分析物吸附的主要参数有纤维表面固定相类型、萃取时间、离子强度、pH值、温度、样本体积和搅拌。对于SPME-GC，分析物解析与时间和温度有关，而对于SPME-HPLC，分析物解析则主要与溶剂类型、体积和时间有关。在实验过程中萃取效果的影响因素主要有以下几方面：
1）纤维表面固定相类型
选用固定相时一般应从两方面考虑：(i)分析物和固定相的极性相匹配，即应当综合考虑分析组分在各相中的分配系数、极性与沸点，根据“相似者相溶”的原则，选取最适合分析组分的固定相；(ii) 灵敏度随固定相厚度的增加而增加。
2）萃取时间
萃取时间是从石英纤维与试样接触到吸附平衡所需要的时间。为保证实验结果重现性良好，应在实验中保持萃取时间一定。影响萃取时间的因素很多，如分配系数、试样的扩散速度、试样量、容器体积、试样本身基质、温度等。在萃取初始阶段，分析组分很容易富集到石英纤维固定相中，随着时间的延长，富集的速度越来越慢，接近平衡状态时即使时间延长对富集也没有意义了，因此在摸索实验方法时必须做富集－时间曲线，从曲线上找出最佳萃取时间点，即曲线接近平缓的最短时间。一般萃取时间在15～180 min。
3）离子强度
向液体试样中加入少量氯化钠、硫酸钠等无机盐可增强离子强度,降低极性有机物在水中的溶解度即起到盐析作用，使石英纤维固定相能吸附更多的分析组分。一般情况下可有效提高萃取效率，但并不一定适用于任何组分,如Boyd-Boland等在对22种含氮杀虫剂检验中发现使用多数组分在加入氯化钠后会明显提高萃取效果，但对恶草灵、乙氧氟甲草醚等农药无效；Fisher等在分析酒中污染物时,加入无机盐的比不加的分析结果高25%。加入无机盐的量需要根据具体试样和分析组分来定。
4）pH
改变pH值同使用无机盐一样能改变分析组分与试样介质、固定相之间的分配系数,对于改善试样中分析成分的吸附是有益的。由于固定相属于非离子型聚合物，故对于吸附中性形式的分析物更有效。调节液体试样的pH值可防止分析组分离子化，提高被固定相吸附的能力。对于酸性化合物，萃取效率随pH值降低而提高，在低pH值，酸性化合物的酸-碱平衡移向中性化和物，更有利于分析物被固定相吸附。相反，对于碱性化合物则是随pH值降低，化合物离子化，萃取效率随之减小。在实际检测中发现，pH值在4～11间改变，对三嗪、硝基苯胺、取代尿嘧啶、硫代氨基甲酸酯、氯代乙酰胺、联苯醚、氨基化合物和含氧二唑类除草剂萃取效率无影响。然而在pH 2时，联苯醚和二硝基苯胺的萃取效率提高。
5）温度
分析物进入固定相的平衡时间与萃取温度有关，因而需要选择适当的萃取温度促使在合理的时间范围内获得满意的灵敏度。对于浸入式SPME，适当升高温度可使分子运动加快，分子扩散速度更快，从而萃取相/水相之间的平衡时间可以缩短。其对三嗪和硫代氨基甲酸酯的优化萃取温度在55～60℃。对于顶空式SPME，适当升高温度可以提高液上气体浓度，从而提高分析灵敏度。其对人体血液和尿液中三嗪类除草剂的最佳萃取温度介于90～100℃之间。
6）搅拌
萃取效率与分析物在样本基质和固定相间的平衡有关，而分析物平衡时间与分析物在水相间质量传递速率有关。搅拌和超声波均能使分析物从基质中快速转移至固定相，从而降低萃取时间。虽然搅拌速度越快，平衡时间越短，但是过度搅拌也会干扰平衡时间和精密度。
7）样本体积
由于固相微萃取是一个固定的萃取过程，为保证萃取的效果需要对试样量、试样容器的体积进行选择。Denis等在利用顶空法检测14种半挥发性有机氯农药的研究中指出，试样量与试样容器的体积对于保证结果有很大关系，试样量与试样容器体积之间存在有匹配关系，试样量增大的情况下，重现性明显变好,检出量提高。
8）解析
对于SPME-GC来说，GC的汽化室可用于分析物从纤维上的解吸。当温度上升时，分析物对纤维的亲和力下降从而释放出来。汽化室较小的体积能够保证解吸下来的分析物由载气迅速转入色谱柱。对于大多数化合物而言，解吸通常在两分钟内完成。GC的热解吸受若干参数的影响，如汽化室的温度和载气的流速等，它们决定了SPME的解吸时间。一般，汽化室温度的设定在可保持纤维涂层稳定的最大温度。最高解析温度有助于减少滞留影响。一般SPME-GC的热解析最佳温度和时间分别为200～300℃、2～15 min。
SPME-HPLC的联用与GC联用的不同之处在于解吸过程和探针的形状，即HPLC是通过使用微量溶剂洗涤萃取纤维来解析萃取物并直接进入后续的HPLC分析，而非GC快速热解吸。在SPME和HPLC联用中必须解决接口技术，以实现分析物的解吸。
1997年Eisert和Pawliszyn提出了一种自动进样的SPME-HPLC联用装置—In Tube SPME-HPLC。在HPLC的自动进样阀和取样器之间的是一根涂有SPME固定相涂层的GC石英毛细管。当处于进样位置时，针头吸入的样品溶液中的分析物分配到石英管壁的固定相上，切换到装样位置时，吸入溶剂，将被吸附的组分转移到样品管中。再切换到进样位置，样品管内的溶液随流动相进入分析柱，进行色谱分析。此装置的特点是自动进样，避免了峰展宽。Daimon等还提出一种改进的SPME- HPLC接口。在分析时，用电加热石英纤维的导管，增加解吸率。
SPME与传统的LLE、SPE相比，快速、简单、不需要使用溶剂，可以与GC、HPLC联用，有好的线性和灵敏度。但是SPME需要专门的萃取器，价格比较昂贵，纤维的使用寿命有限，需要不停更换。