高效液相—核磁共振联用技术在中药分析中的应用.doc

药物分析综述

题目：液相—核磁共振联用技术在中药分析中的应用
组员姓名：黄志华、窦文渊、彭啟柏
所在学院： 药科学院
专业班级： 药学05（5）班
学号： 0503501564、0503501565、0503501535
日期：2008-6-2

液相—核磁共振联用技术在中药分析中的应用

摘要:
HPLC一NMR联用技术是一种高效、快速获得混合物中未知化合物结构信息的术，近年来，它在药物研究中的应用日益广泛。本文介绍了HPLC一NMR联用技术及其在中药分析中分离、结构鉴定、构型分析等方面的一些研究应用。
关键词
液相—核磁共振联用技术(LC－NMR) 中药分析

中药是中华民族的瑰宝，数千年来，中药对中国人民的医疗保健发挥了巨大的作用特别是随着我国加入世界贸易组织后，以仿制为主的西药研制将遇到严重挑战，中药己成为我国最有优势的研究与开发领域。充分利用现代科学技术的方法和手段，按照国际认可的医药标准规范，研究开发能够正式进入国际医药市场的中药产品，推动中药的现代化，不仅具有经济效益也具有巨大的社会效益。在这其中，中药及其复方的药效物质基础研究是中药现代化研究的重点与突破口，它关系到药材、饮片，中药制剂和中成药产品等的质量控制等。
中药的真伪鉴别和品质评价是临床应用、成药制备、中药科研不可缺少的前提条件。我国药材品种繁多，存在南北差异、同名异物、同物异名等情况，混淆品极多，疗效也各不相同。而且中药的有效成分和环境、产地、采收季节等因素也有很大关系。加之近年来，假冒伪劣中药充斥市场，为控制中药质量、保证临床用药安全和有效，需要对中药进行严格鉴定。随着科技不断发展，从最原始的眼观、鼻闻、口尝、手摸到显微鉴别和理化鉴别，再到光谱、色谱等现代技术的应用，中药鉴定技术越来越多元化。但每一种分析技术均有其适用范围和局限性，将单一的分析技术联合起来，不仅能获得更多的信息，而且可能产生单一分析技术所无法得到的新的信息。因此，联用技术已成为中药鉴定发展的一个重要方向。
HPLC虽然是复杂成分的分离中最有力的工具，微处理机的应用，简化了仪器操作，并能够实现全自动化，应用极为广，通过UV可变波长检测器，可获得一些化合物的附加信息，但信息量非常有限，对活性成分的结构鉴定帮助不大。
NMR能够提供大量的结构信息，包括立体化学信息(在某些情况下，它不需其他光谱的信息，就能解析未知物的结构)。因此NMR对中药中活性成分的结构鉴定有很大的帮助。毫无疑问，HPLC－NMR联用技术对中药的分析研究中活性成分的分离和结构鉴定的速度将大大提高。以下对HPLC—NMR联用技术操作及在中药中的分析应用作简单的介绍。
1. HPLC—NMR联用技术
HPLC—NMR联用技术的研究开始于20 世纪70 年代早期发展十分缓慢，主要是因为当时NMR仪的灵敏度还较低，溶剂峰抑制问题也尚未解决。近年来HPLC-NMR联用技术的迅速发展得益于NMR波谱仪磁场强度的提高、HPLC—NMR专用探头的设计及溶剂峰抑制技术的发展，从而解决了动态变化、灵敏度及溶剂抑制(尤其是梯度系统)的问题。当时该仪器可采用停止流动模式,随后不久连续流动模式打通,从此以后,随着仪器设计、磁场强度、流动探头等方面研制水平的提高与改进,以及有效的压制溶剂峰的脉冲序列的建立,使得这项技术现在已广泛应用到实际工作中。
1.1　基本操作模式
LC－NMR联用技术主要有三种操作模式:连续流动操作模式、停流操作模式和峰存贮操作模式。
11.1 连续流动（on-flow）操作模式:样品由HPLC常规检测器（UV等）出口，用毛细管直接连接到专用NMR探头的液槽，毛细管的长度为2m。随着分离连续获得NMR图谱，一次分析可得到所有组分的NMR信息，然而由于样品溶液浓度低，NMR采样时间短（通常扫描16次），很难得到分辨率良好的NMR图谱。
1.1.2 停流(stop-flow)操作模式：当样品色谱峰最高点到达NMR液槽的中心位置时，停止流动，进行一维或二维NMR采样，直至获得良好的NMR图谱。然后再启动输液，恢复正常HPLC条件，继续下一色谱峰的NMR测定。在出峰时停泵，可以获得较好的NMR图谱。
1.1.3 峰存贮操作模式：当欲分析组分较多而各组分的含量较低时，为避免由于多次暂停LC分离而带来峰扩散现象，可采用峰存贮操作模式。正常色谱分离时当UV检测到色谱峰时将流出物收集并暂时贮存到不同的毛细管回路内，由NMR谱仪逐一离线测定各流分。该模式下的样品需要量低于停流操作。这样既不中断HPLC过程，又能获得全部成分的良好的NMR图谱。除用毛细管回路贮存色谱成分外，还有小柱截留法。
1.2　溶剂峰抑制方法
大多数HPLC体系采用反相柱,使用2种或3种溶剂的混合物作洗脱液,除D2O外,其它氘代溶剂作为常规洗脱液太昂贵。因此,在线反相HPLC - NMR实验中常采用含质子的溶剂,如CH3 CN 和CH3 OH 等。常用的MeOH - H2 O 和MeCN - H2O体系在NMR中有很强的响应值,可能掩盖分析对象。为了消除NMR波谱仪接收器的动态范围问题,溶剂质子信号必须加以抑制,常用的方法有:
　　(1)采用氘代溶剂,但价格昂贵,适合于μHPLC。
　　(2)通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和。
　　(3)脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰。
近年来由于毛细管HPLC的发展,溶剂的消耗量大为减少,在实验中有可能完全使用氘代试剂作洗脱液,不必使用溶剂抑制。
1.3　灵敏度的提高
提高HPLC - NMR灵敏度的方法有:
(1) 利用SPE等方法浓缩样品。要得到高分辩的谱图,溶液中不能有悬浮的灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。测试微量样品时,要带手套处理样品,以防手指上的微量物质溶在溶液中,否则1H谱中δ1. 4会出现一个7 Hz裂分的双峰,δ4还有一个四重峰,可能来自丙氨酸或乳酸。
(2) 提高磁场强度(900 MHz NMR已经商品化)。核磁谱仪场强的不断升高,从某种程度上增加了NMR的灵敏度和分辩力.从1987年第一台600MHz的NMR仪,到现在已经发展到900MHz了。
(3)降低探头温度(商品化的低温探头) 。利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头,当样品温度由温控单元维持时,采用闭环或开环制冷系统使超导线圈温度降到25K,消除了谱图的电噪声相对常规5 mm探头而言,其潜在灵敏度可以提高8 ～10 倍。国内已有此类探头使用, 500MHz信噪比达3 200∶1,可达到800MHz水平。
2. HPLC—NMR在中药分析中的应用
2.1 HPLC—NMR联用技术在检测植物药有效成分中的应用
2.1.1 半夏水提取物中的应用
陈平、梁世瓢等利用HPLC—NMR对半夏水提取物中8种化合物的结构进行分析. 他们采用 Loop-collection（环收集方式）的工作方式，将液相分离后不同组分分别收集在不同馏分收集环(Loop)里，然后逐个注入流动探头，再根据化合物浓度不同,进行不同采样时间的核磁共振检测，根据需要增加低浓度样品的核磁采样时间。由实验结果分析而得半夏水提取物中的8种化合物分别是胞昔、酪氨酸、尿普、腺喋吟、鸟营、苯丙氨酸、腺营和色氨酸(Figure2-6)。实验过程中被测组分从loop中进入NMR分析，在数据采集前必须利用溶剂抑制技术去除流动相产生的巨大的共振信号的干扰。使用溶剂抑制技术带来的一个问题是如果被测化合物的NMR共振信号恰好在溶剂峰包埋之下，则这些信号将与溶剂信号一样被压掉。当被测化合物是未知化合物时，这些信号的缺失将会严重。
2.1.2 对蛇葡萄根的化学成分的研究
王映红、李娜等通过用HPLC—NMR仪对葡萄科蛇葡萄根的化学成分进行研究。在INOVA－2500 LC－NMR上, 用停止流动的方法采集LC－NMR 1H－NMR谱及WEGCOSY谱. 进样量为25μL , 1H－NMR 谱采样时间为1.5 s ,累加次数为416。 WETG2COSY的F1 , F2 均为60000. 0 Hz , nt = 24 , ni = 128 ,总采样时间为1h7min37。由结果鉴定出其中主要成分的结构为一－白藜芦醇四聚体Vitisin B。
2.1.3 对长叶框树中的木脂素类化合物的分析
Zhao等用停止流动HPLC-NMR鉴别了紫杉科植物长叶框树中的木脂素类化合物。长叶框树针叶样品经提取、固相提取等预精制后，以梯度洗脱HPLC分得8个化合物峰，通过停止流动方法记录1H－NMR谱再结合EI-MS等对其中7个化合物作了结构研究。峰1-6分别为化合物络石昔元、去甲络石糖昔元、牛芬昔元、欧侧柏内醋甲基醚、松脂素和甲基松脂素。峰7的HPLC-1HNMR谱与1-6的不同，提示为一个新木脂素型化合物。峰8通过HPLC－NMR测定，表明是一个未知结构的非木脂素类化合物。
2.1.4 对棕榈油提取物的分析
StrohscheinL等以C30HPLC－NMR联用研究了富含维生素E同系物的粗棕榈油提取物。通过对图谱分析分离、鉴定去粗棕榈油提取物中有δ一和γ-型生育三烯酚、β－型生育三烯、a一生育三烯酚、a一生育酚、a一生育烯酚。本方法用甲醇作为流动相而不需加缓冲液的色谱条件对联用技术来说是理想的。
2.1.5 山蓝色素前体分子组成与化学变化的研究
谢运昌、文永新等用HPLC－NMR联用技术研究山蓝中山蓝色素前体的分子组成与化学变化，由分析1H—NMR图谱表明山蓝色素前体分子有由2个紫蓝氨酸残基和1个氨基酚残基键合而成的片段，在室温下放置后，氨基酚结构转变为醌结构。研究结果为山蓝色素前体、山蓝色素及其相关化合物的结构测定提供了重要数据为山蓝色素的化学、山蓝色素形成机理的阐明起到了关键作用。
2.1.6 LC一NMR联用技术分析黄连中微量生物碱的研究
王爱国、冯幸章等运用INVOA 500 LC一NMR联用仪对黄连中微量生物碱进行LC一NMR研究，分别测定几个微量成分的1H—NMR，根据LC一NMR分析，推定黄连总碱中几个微量成分为化合物(1)为5一羟基一13一甲基小檗碱；化合物(2)为5-羟基一棕榈碱；化合物(3)为13一甲基小檗碱；化合物(4)为棕榈碱，该研究对黄连成分的研究有重要的指导意义。
2.2 HPLC—NMR对双氢青蒿素差向异构体转化的研究
刘宁、杨腊虎等通过HPLC—NMR仪对双氢青蒿素进行分离和测定。在HPLC色谱条件下所分离而得的2个异构体以工作频率为500MHz的NMR仪进行分析,用氘代甲醇为溶剂,并兼作化学位移内标,在室温下对溶解在氘代甲醇30min后和异构体转化平衡时进行氢谱检测。在对实验初期和放置一段时间后的1H—NMR图谱比较,在1H—NMR图谱中明显一个峰位高低转化的过程,说明双氢青蒿素在溶液中存在异构体的转化过程。并由图谱得出2个异构体的1H—NMR图谱主要在5位－H于12位－H化学位移δ值有明显的差异。
2.3 LC-NMR在用血清药化学方法对单味中药内活性成分进行研究中的应用
杨春、梁晓天等 以“血清药物化学”方法为研究思路，用LC-NMR联用技术对服用当归后大鼠的血清样品进行研究，分析其中的活性成分。用HPCL法在大鼠服药后的血清中发现了5个当归活性成分，在肝脏中发现8个当归活性成分。用HPLC一NMR联用技术对肝脏和血清中2个主要活性成分研究表明，它们为莫本内酯和6，7一二羟基一3a，6，77a-四氢藁本内酯。在服药后大鼠的肝脏中，阿魏酸的含量最高，而6, 7-二羟基-3a,6,7,7a-四氢藁本内酯的含量比藁本内酯高。在血清中，6, 7-二羟基-3a,6,7,7a-四氢藁本内酯的含量最高，而藁本内酯的含量较低，未发现阿魏酸。在大 鼠 服 药后1.Oh 的肝脏中发现阿魏酸的含量最高，而藁苯类化合物的含量并不高。这可能由于阿魏酸的水溶性大，而藁苯类为脂溶性化合物，因此阿魏酸在体内吸收较好。但在1.Oh 的血液中并未发现它的存在，可能其代谢较快。由于体内生物样品中的活性成分来源于中药，在排除代谢产生的成分后，通过对中药中相应成分的检测，可知中药在体内的活性成分，这为中药的研究提供了一种新的思路。
总结
实践证明HPLC－NMR 在结构具有规律性的同类化合物的鉴定中,可起到提高工作效率、避免盲目重复劳动的作用. 在中药分析的提取分离工作中不但有指导作用,还可以提供较为准确的光谱信息, 排除杂质的干扰,大大降低了中药中混合物结构分析的难度，从而可以确定其结构和立体构型。
在过去几年里，虽然HPLC－NMR联用技术的灵敏度已大大提高，并在分离和鉴定上有了一些成功的应用，但仍不够满意，柱与池间以及池本身造成的峰扩散需进一步降低。不断提高NMR的灵敏度和色谱光谱分辨能力，使得实验结果更准确可靠。

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