放射免疫技术.ppt

免疫学检验第十九章 放射免疫技术1.放射免疫技术的基本概念及类型2.放射标记物的鉴定与纯化。3.RIA和IRMA的测定原理及关键技术。4.RIA和IRMA的临床应用与评价本章要点目录 放射性核素和放射性标记物的制备1放射免疫分析性2免疫放射分析3放射免疫技术是将放射性核素高敏感的示踪特点和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体外测定超微量物质的新技术。其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定。具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医学检验中得到了广泛应用。放射免疫技术根据其方法学原理的不同主要有两种类型：RIA和IRMA。前 言第一节 放射性核素和放射性标记物的制备 放射性核素作为放射性免疫技术的标记物，选择何种放射性核素以及如何制备放射标记物（将放射性核素与抗原或抗体连接），是建立放射免疫技术的基础。一、放射性核素的基本知识 基本概念指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时释放射线（、），又称为放射性衰变。基本类型 依据其衰变方式 衰变、衰变、衰变 最常用的放射性核素是125I 125I的优点 化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得 高比活性的标记物；在衰变过程中产生射线，便于测量且效率高；半衰期适中（60天左右），且废弃物较容易处理。125I的缺点 用125I取代H，可能使原物质免疫活性受到影响；易因发生辐射损伤而使标记抗原变性；作为商品化试剂的产品货架期较短。放射性核素放射活性的检测利用射线照射闪烁体（NaI晶体），导致晶体分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波长的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换成光电子并放大107倍；从光电倍增管输出的电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处理，并在定标器上显示。二、放射性核素标记抗原抗体方法 主要包括间接标记法直接标记法（氯胺T法）125I-125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应（一）直接标记法氯胺T法（Ch-T）氯胺T将125I的I氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成稳定的放射标记物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亚硫酸钠（还原剂）终止反应。使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少Ch-T用量要低控制总反应体积200l反应时间1分钟2分钟弱碱性反应条件（二）间接标记法预先将125I用Ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。三、放射标记物的纯化与鉴定（一）放射标记物的纯化因游离的125I与125I标记抗原（抗体）分子的大小相差悬殊，故采用凝胶层析即可进行分离纯化 聚合、损伤物 标记蛋白游离125I比放射活性 高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好 （二）放射标记物的鉴定计算法自身置换法 比放射活性单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高，将影响标记物免疫活性 比放射性计算法 结果欠准，计算简便依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.比放射性自身置换法比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性。作一条常规的RIA标准曲线，反应体系包括定量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、限量抗体；同时另作一条不加非标记标准品、只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲线。自身置换曲线 标准曲线 反应平衡后，测定B/T%。若从两条曲线上取一点相同的B/T%，则（标记物+标准品）标准曲线=（标记物）自身置换曲线。由此便可直接计算标记抗原的含量，并进一步求得比放射活性。自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只适用于适用于适用于适用于RIARIARIARIA的标记抗原。使用时应注意：的标记抗原。使用时应注意：的标记抗原。使用时应注意：的标记抗原。使用时应注意：标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力 应相同；应相同；应相同；应相同；非特异性结合应较小，且计算时应扣除；非特异性结合应较小，且计算时应扣除；非特异性结合应较小，且计算时应扣除；非特异性结合应较小，且计算时应扣除；制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤 应相同，特别是应相同，特别是应相同，特别是应相同，特别是B B B B与与与与F F F F分离的条件要一致。分离的条件要一致。分离的条件要一致。分离的条件要一致。第二节 放射免疫分析 放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记的抗原（Ag*）与未标记抗原（Ag）竞争结合特异抗体（Ab）来对待检样品中的抗原进行定量测定的一种技术。一、检测原理 RIA属于竞争性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待测物Ag)对特异性抗体具有相同的结合力，当三者同时存在于同一反应体系时，Ag*和Ag相互竞争结合特异性抗体。Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。(标准Ag/样品Ag)二、方法与类型 非平衡法，即标准品抗原（或待检样本）和特异性抗体，优先使非标记抗原与特异性抗体达到平衡，然后再加入标记抗原竞争与抗体结合。两种类型平衡法，即标记抗原、标准品抗原（或待检样本）、特异性抗体同时加入反应体系中。三、关键技术 抗原抗体反应分离结合标记物（分离技术）放射性测定数据处理Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)（一）抗原抗体反应 二抗体沉淀法 PEG 沉淀法 PR 试剂法 活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 （二）分离结合标记物 晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B与F的总和（三）数据处理 标准曲线RIA由于具有敏感度高、特异性强、精密度高、重复性好、用血量少、可测定小分子量和大分子量物质等优点，在医学检验中应用极为广泛，常用于各种激素和药物等的测定。但由于放射性核素的放射性对人体会产生一定的危害性，且其废物的储存和销毁会对环境造成污染，因此操作时必须加以注意。四、评价与应用 第三节 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是从放射免疫分析（RIA）的基础上发展起来的核素标记免疫测定，其特点为用核素标记的抗体直接与待检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。一、检测原理 IRMA属于非竞争性免疫结合反应，其基本检测 原理是将放射性核素（125I）标记在抗体上，并 用过量的标记抗体与待测抗原进行非竞争性结合 反应，并采用固相免疫吸附方式对B和F进行分离。检测免疫复合物的放射性，从而得到待检样本的 浓度。二、方法与类型（一）单位点 IRMA（二）双位点 IRMA三、关键技术 抗原抗体反应分离技术放射性测定数据处理Ab*AgAb(待检Ag)（一）抗原抗体反应*固相吸附分离技术（二）分离技术 一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预包被抗体稀释到3g/ml10g/ml，室温过夜，弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达到分离的目的；然后，再加入1%牛血清白蛋白溶液，封闭、保存备用。晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B与F的总和（三）数据处理 IRMA的优点 效率高、操作简便 灵敏度高 特异型强 稳定性好四、评价与应用 IRMA的缺点 抗体用量较多 抗体的纯化较难RMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。抗体适用于大分子蛋白质和多肽类激素的检测分析，如肿瘤标志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降钙素、HBsAg等，某些难以标记的病毒抗原也可通过IRMA进行检测。小 结 放射免疫技术是应用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定的一种技术。有两种类型经典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射分析（IRMA）。放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞争性结合限量的抗体;免疫放射分析是将放射性物质标记在抗体上，属于非竞争性免疫结合反应。放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于微量物质的定量测定。但由于放射性核素的放射性对人体和环境会产生一定的危害和污染，因此操作时必须加以注意。