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实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定

硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋ → NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对 – 氨基苯磺酰胺）及 α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：

生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。 NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ 离　体　法
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂
1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
7 ．提取缓冲液： 0.1211 g 半胱氨酸、 0.0372 g EDTA 溶于 100 mL 0.025 mol ／ L pH 8.7 的磷酸缓冲液中。
8 ． 2 mg/mL NADH 溶液： 2 mg NADH 溶于 1 mL 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液中（临用前配制）。
（三）仪器设备
冷冻离心机，分光光度计，天平（感量 0.1 mg ），冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。
三、实验步骤
1. 标准曲线制作
取 7 支洁净烘干的 15 mL 刻度试管按表 11 – 1 顺序加入试剂，配成 0 ～ 2.0 μg 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在 25 ℃下保温 30 min ，然后在 540 nm 下比色测定。以亚硝态氮（ μg ）为横坐标（ x ），吸光度值为纵坐标（ y ）建立回归方程。

表 11-1 制作标准曲线时各溶液加入量
试 剂
管 号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液（ mL ）
0.0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水（ mL ）
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
1 ％磺胺（ mL ）
4
4
4
4
4
4
4
0.02 ％萘基乙烯胺（ mL ）
4
4
4
4
4
4
4
每管含亚硝态氮（ μg ）
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0

2. 样品中硝酸还原酶活力测定
（ 1 ）酶的提取 称取 0.5g 鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻 30 min ，取出置冰浴中加少量石英砂及 4 mL 提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在 4 ℃、 4000 r/min 下离心 15 min ，上清液即为粗酶提取液。
（ 2 ）酶的反应 取粗酶液 0.4 mL 于 10 mL 试管中，加入 1.2 mL 0.1 mol/L KNO 3 磷酸缓冲液和 0.4 mL NADH 溶液，混匀，在 25 ℃水浴中保温 30 min ，对照不加 NADH 溶液，而以 0.4 mL 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液代替。
3 ．终止反应和比色测定
保温结束后立即加入 1 mL 磺胺溶液终止酶反应，再加 1 mL 萘基乙烯胺溶液，显色 15 min 后于 4000 r/min 下离心 5 min ，取上清液在 540 nm 下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（ μg ）。
四、结果计算
单位鲜重样品中硝酸还原酶活性 = [μg ／（ g · h ） ]
式中： X ——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量， μg 。
V l ——提取酶时加入的缓冲液体积， mL 。
V 2 ——酶反应时加入的粗酶液体积， mL 。
W ——样品鲜重， g 。
t ——反应时间， h 。
Ⅱ 活 体 法
一、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
植物的新鲜叶片（豌豆、王米、小麦、大豆等）。
（二）试剂
1. 1% 磺胺试剂： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
2. α - 萘胺试剂：称取 α - 萘胺 0.2 g ，用含 1 mL 浓盐酸的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至 100 mL 。
3. NaNO 2 标准液：称取 0.1 g NaNO 2 ，用蒸馏水溶解，定容至 100 mL 。之后，再吸出 5mL ，用蒸馏水稀释至 1000 mL 。此液每毫升含有 5 μg NaNO 2 ，用时再稀释。
4. 0.2 mol/L KNO 3 ：称取 KNO 3 2.002 g ，用蒸馏水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
5. 0.1 mol/L 磷酸缓冲液， pH7.5 。
（三）仪器设备
三角瓶 50mL ，打孔器（直径 0.5 cm ），真空泵，温箱，分光光度计，移液管 5mL 3 个， 1 mL 2 个， 2 mL 2 个，台天平 1 台。
二、实验步骤
1. 绘制标准曲线
（ 1 ）把每毫升含有 5 μg 的 NaNO 2 标准液稀释成每毫升含有 0.5 ， 1.0 ， 2.0 、 3.0 、 4.0 μg NaNO 2 溶液。
（ 2 ）取 6 支试管， 1 支装入蒸馏水 1 mL ，另 5 支分别装入上述不同浓度的 NaNO 2 溶液 1 mL ，然后向每支试管里加入磺胺试剂 2 mL 及 α - 萘胺试剂 2 mL ，摇匀，在 25 ～ 30 ℃条件下保温 1 h ，冷却后于分光光度计在 540 nm 波长下比色，读出光密度。以光密度为纵坐标， NaNO 2 浓度为横坐标，绘制出标准曲线。
2. 样品的测定
（ 1 ）从田间取回新鲜叶片（豌豆取苗期叶片，高梁取籽粒灌浆期叶片，或取其它叶片均可），用水洗净，吸干水份，用打孔器打出直径 0.5 cm 的叶圆片，用蒸馏水冲洗叶圆片 1 ～ 2 次，用吸水纸把水吸干后，于台天平上称取等重叶圆片两份，每份重 0.5 g 。
（ 2 ）取 2 个 50 mL 三角瓶，分别装入下列溶液： ① 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.5 ） 5mL, 再加蒸馏水 5 mL ， ② 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.5 ） 5 mL, 加 0.2 mol/L KNO 3 溶液 5mL, 然后把三角瓶放在真空干燥器内，接上真空泵抽气，以排除组织间隙的气体，使叶圆片沉于溶液中 , 以便底物溶液进入组织（如果没有真空泵，也可用注射器来代替，把反应液与叶圆片一起倒入 20 mL 注射器中，用手指堵住注射器出口的小孔，然后用力拉注射器使之成为真空，如此抽气、放气、反复多次，也可抽掉叶圆片中的空气，使之沉于溶液中）。放气后，把三角瓶放入 30 ℃温箱中，保温 30 min 。
（ 3 ）保温结束后，从三角瓶中，各吸取反应液 1mL ，分别放入 2 支试管中，然后各加磺胺试剂 2 mL 及 α - 萘胺试剂 2 mL ，混匀，置于 25 ～ 30 ℃条件下反应 1 h ，冷却后，用分光光度计在 540 nm 波长下比色，读出光密度，在标准曲线上查出 NO 2 ˉ含量（ μg/mL ）。
三、结果计算
酶活性（ μg NO 2 ˉ／ g · h ）
式中： C 1 ——从标准曲线上查出的 1 号三角瓶里 NO 2 ˉ含量， μg/mL 。
C 2 ——从标准曲线上查出的 2 号三角瓶里 NO 2 ˉ含量， μg/mL 。
V ——反应液的总体积， mL 。
t ——反应时间， h 。
W ——植物鲜重， g 。

[ 注意事项 ]
1. 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在 4 ℃下进行。
2. 取样宜在晴天进行，让植株充分照光，或施用一定量的硝态氮肥，可增加酶的活性，取样部位应一致。
3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。
4. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。

[ 思考题 ]
1. 测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应在晴
天进行 ?
2. 测定硝酸还原酶活性的离体法和活体法各有何特点 ?