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土壤微生物群落磷脂脂肪酸(PLFAs) 生物标记多样性分析.doc

1、9 土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记多样性分析基金项目: 福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF-Y03)，福建省自然科学基金资助项目(B0410024)；福建省烟草专卖局科技计划项目（闽烟科[2006]18号）；福建省农科院预试课题(A2006YYS09) Foundation Item: The project was supported by specific project of Fujian Finance for the Fund of Science Technology Innovation Team of Fujian Ac

2、ademy of Agricultural Sciences (STIF-Y03); Natural Science Foundation of Fujian(N0.B0410024); Fujian Tobacco Company Sci-technology project(MYK[2006]No.18); Pre-project of Fujian Academy of Agricultural Sciences(A2006YYS09) 作者简介：张秋芳（1973-），女，福建闽清人,硕士，副研究员，主要从事环境微生物及生化物质分析研究。E-mail: qfzhang@;手机(0)13

3、055748230 Biography: ZHANG Qiu-fang(1973-),Master,Associate Researcher,mainly engaged in environmental microbiology and biochemical substance analyse. E-mail: qfzhang@ **通讯作者:刘波，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术和微生物防治研究，Correspondeding author: E-mail：fzliubo@。张秋芳1，刘波1**，林营志1，唐莉娜2，史怀1，杨述省1，周先冶1 （1福建省农科院

4、农业生物资源研究所，福建福州 350003； 2福建省烟草公司，福建福州350003）摘要:以磷脂脂肪酸(PLFAs)作为生物标记是一种可定性和定量地分析土壤微生物群落多样性的方法。本研究应用生态学评价方法，即结合Shannon-Wiener(H1)､Brillouin(H2)､ Mcintosh(H3)多样性指数､丰富度指数(S)和Pielou均匀度(J)､Simpson优势度指数(D)等各多样性指数测度方法，以烟草土壤为例，分析土壤中微生物PLFAs生物标记的多样性､丰富度和均匀度。研究结果表明：不同生长阶段供试烤烟土壤微生物群落中，先后出现了43种PLFAs，PLFAs的生

5、物量于生长后期为最高；各PLFAs的各多样性指数､丰富度和均匀度皆不相同。根据各PLFAs生物标记的含量大小，经聚类分析后得出，可以将其依次分成五大类：Ⅰ类为高含量、高频次和多样性，PLFAs为18:1ω9c的真菌生物标记；第II类：含量仅次于第I类，较高频次和多样性指数，PLFAs为16:0的假单胞菌标记；第III类：较高含量和频次，多样性中等，PLFAs为16:1ω5c的甲烷氧化菌生物标记；第IV类：中等含量，频次较高，多样性中等，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的PLFA，还有表征厌氧细菌的18:1ω7c以及硫酸盐还原细菌的16:0 10Me；第V类：低含量

6、低频次和多样性，其特征生物标记有表征好氧菌的i 15:0 3OH、15:1 i G、a16:0、i16:1 G、i16:1 H、17:0、i17:0、15:0 2OH、15:0 3OH、17:0和17:0 2OH的PLFA，存在有表征真菌的18:3ω6c (6,9,12)、放线菌的17:0 10Me和18:0 10Me以及表征原生动物的20:4ω6,9,12,15c。关键词:土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸(PLFAs)；生物标记；多样性 The diversity of phospholipid fatty acids biomarker for the microbial comm

7、unity in soils ZHANG Qiu-fang 1, LIU Bo 1*, LIN Ying-zhi1, TANG Li-na 2, SHI Huai1, YANG Shu-sheng1 and ZHOU Xian-zi1 (1 Agricultural Bioresource Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350003，China ; 2 Fujian Tobacco Company，Fuzhou，Fujian 350003 China） Abstract：Pho

8、spholipid fatty acids was used as a kind of biomarkers to detected the microbial community diversity qualitatively and quantitatively. The diversity of phospholipid fatty acids in the tobacco soils was analyzed, firstly combining with the evaluation methods of ecology , such as Shannon-Wiener（H1）,Br

9、illouin（H2） and Mcintosh（H3） diversity indexes，the abundance(S)，Pielou evenness（J）and Simpson index（D）. The result showed that: the total 43 kinds of PFLAs in the soils which were tested in the different growing periods of tobacco, the biological amount of PLFAs were the highest in the last growing

10、period in 90 days, and the values of diversity, abundance and evenness for biomarkers were changeble in the tobacco fields, that implied the microbial community fluctuated. The 43 kinds of PFLAs biomarkers could be divided into 5 groups as follows: NO.1 was 18:1ω9c characterized with high quantity,

11、high frequency and diversity, belonging to Fungi; NO.2 had 16:0 which was high quantity only less than that of No1, high frequency and high diversity, belonging to Pseudomonas; NO.3 had 16:1ω5c with characteristics of high quantity, high frequency and moderate diversity, belonging to Methanotrophs;

12、NO.4 had i15:0, a15:0, i16:0 and a17:0 which were related to Aerobic Bacteric’s PLFAs biomarkers, 18:1ω7c which was Anaerobe’s PLFAs biomarkers, 16:0 10Me which was Sulfate Reducing Bacteria PLFAs biomarkers, those of PLFAs biomarkers were moderate quantity and diversity, high frequency; NO.5 had i

13、 15:0 3OH, 15:1 i G, a16:0, i16:1 G, i16:1 H, 17:0, i17:0, 15:0 2OH, 15:0 3OH, 17:0 and 17:0 2OH which were Aerobic Bacteric PLFAs biomarkers, 18:3ω6c (6,9,12) which was fungi, 17:0 10Me and 18:0 10Me which were actinomyces, 20:4ω6,9,12,15c which was protozoa, those of PLFAs biomarkers were low quan

14、tity, frequency and diversity. Key words： Microbial community; Phospholipid fatty acids (PLFAs); Soil; Biomarker; Diversity 前言土壤微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一[1]，土壤微生物多样性，代表着土壤生物活性的特征，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。磷脂脂肪酸（phospholipids fatty acids，PLFAs) 存在于活体微生物细胞膜，分布广泛、含量相对恒定、周转迅速，而且对环境因素的变化敏感

15、分析方法较简单 [2,3,4]，用于鉴定土壤微生物种类和识别微生物类群，具有较高的准确性、稳定性和敏感性，被认为是最有潜力生物标记（biomarker）之一[5,6]，广泛地应用于土壤微生物种类和类群的分析。 PLFA 谱图分析方法的原理是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的PLFA，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，它具有结构多样性和微生物特异性，土壤中PLFAs的存在及其丰度可揭示特定微生物种类或微生物类群的特性[6]，代表着土壤中微生物群落结构微生物指纹图谱，不同土壤微生物菌群的脂肪酸生物标记（PLFAs）特征

16、指纹谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的生物标记[7]。因此，PLFA可以作为微生物多样性指示性的生物标记，阐明土壤样品中微生物群落结构的变化，可以对微生物群落进行识别和定量描述，并为进一步的研究提供相关信息。利用PLFA研究土壤微生物结构变化有过许多的报道，Priha等用PLFA法对某森林中松树、云杉、桦树下土壤进行研究，发现不同树种下的土壤微生物群落结构明显不同，桦树土壤中革兰氏阴性菌(如假单胞菌)数量很多，松树和云杉土壤中革兰氏阳性菌数量则较多[8]。且用于分析PLFA谱图的方法常见的主要有直接将所测得的PLFA用主成分分析（PCA）、部分最小二乘法

17、识别（D-PLS）和群落多余度分析（RDA）等方法[7]进行分析，而利用生态学的分析方法研究土壤微生物PLFAs生物标记的多样性变化来体现土壤微生物群落功能多样性的变化至今尚未见报道。因此，基于微生物磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的特异性和多样性等特点，本研究拟应用生态学的观点，借用各生物多样性指标为评价参数，以烟草土壤微生物磷脂脂肪生物标记为例，并以磷脂脂肪酸的数量和结构作为研究对象，根据微生物磷脂脂肪酸的特异性，揭示土壤微生物群落的动态变化，为了解烤烟施肥技术对土壤微生物群落多样性影响提供参考依据，并建立起一种用以评价土壤微生物群落功能多样性的新的评价方法和模式。 1

18、材料与方法 1.1 供试材料供试土壤取自福建省烟草农业研究所试验基地。供试烤烟品种为K326。试验土壤为水稻土，前茬作物为水稻。供试烟田土壤基本理化性状：土壤pH值5.0, 有机质 20.9 g/kg，碱解氮 99.0 mg/kg，速效磷8.8 mg/kg，速效钾87.0 mg/kg，水溶性氯2.0 mg/kg。所用有机肥均为完全腐熟，各种有机肥养分含量：菜籽饼肥的全N 43.0 g/kg，P2O5 28.0 g/kg，K20 21.0 g/kg；鸡粪（福建圣农养鸡场提供）全N 23.0 g/kg，P2O5 29.0 g/k，K 2034.0 g/kg？。烟草栽培试验自2007年

19、3月进行，共设不施肥（CK）、施用纯化肥、25%菜籽饼肥、25%鸡粪4个处理，每处理重复3次。田间管理按烟草生产标准进行。取烤烟定植后0d（基础土样）、30d、60d和90d耕作层烟草根际土壤新鲜土样，混匀，进行磷脂脂肪酸的提取和测试分析。 1.2 土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记分析方法土壤微生物群落结构分析，采用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法。磷脂脂肪酸的提取过程和分析参考Frostegård和Kourtev方法[9,10]，操作步骤为：将20ml的0.2moL/L的KOH甲醇溶液和4g的新鲜土样加到50ml的离心试管中，混合均匀，在37℃下温育1h(脂肪酸释放，并

20、甲脂化，样品10min涡悬1次)。加入3ml 1.0mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（PLFAs）转到有机相中，600r/min离心15min后，将上层正己烷转到干净试管中，在N2气流下挥发掉溶剂。将磷脂脂肪酸（PLFAs）溶解在1ml体积比为1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液中,用作GC分析。采用美国Agilent6890N型气相色谱仪，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，l70℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持90s；汽化

21、室温度250℃、检测器温度300℃；载气为H2(2ml/min)、尾吹气为N2(30ml/min)；柱前压l0.00 psi(1psi=6.895kPa)；进样量lμl，进样分流比100:1。磷脂脂肪酸（PLFAs）的鉴定采用美国MIDI公司(MIDI,Newark,Delaware,USA)开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的Sherlock MIS 4.5系统(Sherlock Microbial Identification System)。 1.3 数据分析（1）PLFAs生物标记指纹图谱及其数据利用将脂肪酸分析结果绘制成指纹图谱图，将相关参数列表。对指纹图谱进行解读和对脂肪酸

22、分析的参数进行说明，对利用的数据进行归类。（2）PLFAs生物标记数量结构分析将分析结果重复处理计算平均值，构建以脂肪酸生物标记为样本，以不同处理施肥方法为指标的数据矩阵，分析特征脂肪酸生物标记在不同施肥处理土壤中的变化，揭示土壤特征微生物的变化。（3）PLFAs生物标记多样性分析本研究将脂肪酸生物标记作为数量测度，引入生态学多样性测度Shannon-Wiener（H1）[11,12]、Brillouin（H2）[13]、 Mcintosh（H3）[11]多样性指数、丰富度指数(S) [11,14]和Pielou均匀度（J）[11,14]、Simpson优势度指数（D）[14]

23、等方法，分析微生物PFLAs生物标记。 1）Shannon-Wiener多样性指数（H1）计算公式为[11]： H =-∑PilnPi 式中，Pi=Ni/N，Ni为处理i的特征脂肪酸个数，N为该试验中总特征脂肪酸个数。S为特征脂肪酸i在供测土样中出现的次数，即丰富度指数[11]。 2）Pielou均匀度指数（J）计算公式为[11]： J=-∑PilnPi/lnS 式中S为群落中的脂肪酸的总种类数。 3）Simpson优势度指数（D[14]）计算公式为： D=1-∑Pi2 ，式中，Pi种特征脂肪酸占该试验中总的特征脂肪酸个数比例。 4）Brillouin多样性指

24、数（H2）[13] 计算公式为： H2= 式中，n1为第1个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，n2为第2个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，ni为第i个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，N为所有供试处理中磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记出现的个体总和。 I 5）Mcintosh多样性指数（H3）[11] 计算公式为： H3 = 式中，N为特征脂肪酸总数；Ni为第i个处理的土样微生物特征脂肪酸个数；S为磷脂脂肪酸生物标记（PLFAs）生物标记总种类数。（4）土壤微生物群落PLFAs生物标记数聚类分析以不同施肥处理数据为指标，以脂肪酸生物标

25、记为样本，构建分析矩阵。以欧氏距离（Euclidian Distance）为聚类分析的尺度，用最短距离法对矩阵进行系统聚类，分析利用多样性指标将脂肪酸生物标记归类的结果，阐明其相似程度。 2结果与分析 2.1土壤微生物群落PLFAs生物标记指纹图谱及其数据利用的诠释试验结果见图1和表1。图1为从土壤样品Z-7中所提取的微生物PFLAs进样后所得到的气相色谱图，为该样品中所提取到的总PFLAs的图谱。其中，横坐标表示各PLFAs在气相色谱中出现特征峰的时间，纵坐标则表示各PLFAs的峰高。图1. 烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸气相色谱图 Fig1. Chromatogr

26、am profile of phospholipids fatty acids of microbial community in flued-tobacco soil sample Z-7 表1则为该土壤样品微生物群落PFLAs标记的信息表，是将图1中的气相色谱图信息进行量化，转化成数据形式。其中，retention time (RT)表示各PLFAs特征峰的滞留时间；Response表示各PLFAs特征峰的反应区域值，体现了各PLFA的含量；area/ height ratio（Ar/Ht）表示反应区域/峰高度比值；RFact表示相关因子系数；the equivalent chain

27、 length (ECL)表示各磷脂脂肪酸的相对链长度；Peak Name指各磷脂脂肪酸特征峰名称；Percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占总脂肪酸的百分数，Comment1、Comment2表注解1、2。特定的生物标记指示着特定的微生物，总PLFA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的。例如,表1中，TBSA 10Me18:0脂肪酸为放线菌的特异性生物标记，其各参数分别为：特征峰滞留时间(RT)值是14.920min，特征峰值Response为8976，表示其相对生物量的大小；面积/峰值比（Ar/Ht）为0.073；因子相关系数（RFact）为0.879；该PLFAs相对链长度

28、ECL)为18.392；该PLFAs峰名（Peak Name）为TBSA 10Me18:0，该特征PLFAs占总提取的PLFAs量的百分数（Percent）为1.98，其相对链长度的偏离度为0.000。脂肪酸浓度通常应用标准品甲基十九烷脂肪酸(19:0)作为内标来进行定量测定[1]，可以将表示各特征PLFAs相对生物量的Response值换算成各脂肪酸的具体含量，而且Peak Name磷脂脂肪酸各特征峰通过比对可以定性地确定脂肪酸名称[15]。另有研究表明，不同的提取方法，出现的特征峰数量，即PFLAs种类可能不同。在本试验条件下，各供试土壤中所获得的PLFAs生物标记最多的处理有43个

29、特征峰，即可能出现有43种不同的PFLAs可作为生物标记指示土壤微生物群落的多样性。表1. 烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸信息表 Table2. Phospholipids fatty acids information of microbial community in the flued-tobacco soil sample Z-7 滞留时间( 特征峰值面积/峰值比因子相关系数相对链长度峰名百分数注解1 注解2 RT Response Ar/Ht RFact ECL Peak Name Percent Comme

30、nt1 Comment2 1.698 6.298E+7 0.024 ---- 7.046 SOLVENT PEAK ---- < min rt 4.638 1262 0.031 ---- 11.730 ---- 4.890 1654 0.041 1.102 11.998 12:0 0.46 ECL deviates -0.002 Reference 0.000 5.126 868 0.040 ---- 12.197 ---- 5.199 456 0.036 ---- 12.260 ----

31、 5.259 305 0.029 ---- 12.311 ---- 5.321 714 0.031 ---- 12.363 ---- 5.417 1036 0.055 1.079 12.444 11:0 3OH 0.28 ECL deviates 0.006 5.619 569 0.031 1.070 12.616 13:0 ISO 0.15 ECL deviates 0.002 Reference 0.004 5.750 3494 0.032 ---- 12.727 ----

32、 6.073 779 0.066 1.051 13.000 13:0 0.21 ECL deviates 0.000 Reference 0.003 6.377 2379 0.075 ---- 13.219 ---- 6.509 962 0.044 ---- 13.314 ---- 6.574 930 0.038 ---- 13.360 ---- 6.690 786 0.033 ---- 13.443 ---- 6.935 1591 0.035 1.024 13

33、619 14:0 ISO 0.41 ECL deviates 0.000 Reference 0.002 7.085 7151 0.036 ---- 13.727 ---- 7.178 2628 0.049 ---- 13.794 ---- 7.324 2517 0.053 1.013 13.899 14:1 w5c 0.64 ECL deviates -0.002 7.463 5918 0.040 1.009 13.998 14:0 1.50 ECL deviates -0.002 Refer

34、ence 0.000 7.739 2157 0.059 ---- 14.174 ---- 7.909 4001 0.071 ---- 14.283 ---- 8.027 1222 0.035 ---- 14.359 ---- 8.163 2290 0.059 0.992 14.445 15:1 ISO G 0.57 ECL deviates 0.005 8.247 838 0.044 0.990 14.499 unknown 14.502 0.21 ECL deviates -0.0

35、03 8.440 17687 0.041 0.985 14.622 15:0 ISO 4.37 ECL deviates -0.001 Reference 0.001 8.593 16581 0.048 0.982 14.720 15:0 ANTEISO 4.09 ECL deviates 0.007 Reference 0.009 8.776 4200 0.055 ---- 14.838 ---- 8.929 1605 0.051 ---- 14.935 ---- 9.028 3981 0.0

36、41 0.972 14.998 15:0 ---- ECL deviates -0.002 9.121 785 0.055 ---- 15.054 ---- 9.289 2741 0.075 ---- 15.154 ---- 9.417 1454 0.050 ---- 15.230 ---- 9.545 1013 0.043 ---- 15.306 ---- 9.630 1148 0.041 ---- 15.356 ---- 9.779 2964 0.06

37、5 0.958 15.445 16:1 ISO G 0.71 ECL deviates 0.003 9.957 2052 0.048 0.955 15.551 16:0 N alcohol 0.49 ECL deviates 0.001 10.085 13762 0.045 0.952 15.626 16:0 ISO 3.29 ECL deviates -0.001 Reference 0.001 10.247 9304 0.041 0.949 15.723 16:0 ANTEISO 2.22 ECL deviates

38、 0.005 10.406 17676 0.047 0.946 15.817 Sum In Feature 3 4.20 ECL deviates -0.005 16:1 w7c/15 iso 2OH 10.560 15122 0.045 0.944 15.909 16:1 w5c 3.58 ECL deviates 0.000 10.711 73913 0.044 0.941 15.999 16:0 17.46 ECL deviates -0.001 Reference 0.000 10.952 3221 0.054

39、0.937 16.137 15:0 ISO 3OH 0.76 ECL deviates 0.003 11.236 12256 0.058 ---- 16.300 ---- 11.467 13083 0.061 0.929 16.432 16:0 10 methyl 3.05 ECL deviates 0.000 11.608 3783 0.077 0.927 16.513 15:0 3OH 0.88 ECL deviates 0.010 11.810 7610 0.045 0.923 16.629 1

40、7:0 ISO 1.76 ECL deviates -0.001 Reference 0.000 11.971 13170 0.045 0.921 16.721 17:0 ANTEISO 3.04 ECL deviates -0.002 Reference -0.001 12.096 2396 0.056 0.919 16.792 17:1 w8c 0.55 ECL deviates 0.000 12.265 3650 0.049 0.916 16.889 17:0 CYCLO 0.84 ECL deviates 0.001

41、Reference 0.003 12.455 3372 0.048 0.914 16.998 17:0 0.77 ECL deviates -0.002 Reference 0.000 12.526 3452 0.045 0.912 17.038 16:1 2OH 0.79 ECL deviates -0.010 12.660 598 0.040 ---- 17.114 ---- 13.075 1402 0.076 ---- 17.349 ---- 13.184 3422 0.053 0.903

42、 17.410 17:0 10 methyl 0.78 ECL deviates 0.001 13.337 1685 0.056 ---- 17.496 ---- 13.485 6839 0.065 0.899 17.580 18:3 w6c (6,9,12) 1.54 ECL deviates 0.003 13.737 45048 0.053 0.895 17.722 Sum In Feature 5 10.13 ECL deviates 0.002 18:2 w6,9c/18:0 ANTE 13.824 63

43、222 0.048 0.894 17.772 18:1 w9c 14.19 ECL deviates 0.003 13.916 16235 0.046 0.893 17.823 18:1 w7c 3.64 ECL deviates 0.000 14.057 9780 0.058 ---- 17.903 ---- 14.226 16738 0.049 0.888 17.998 18:0 3.73 ECL deviates -0.002 Reference -0.001 14.434 11841 0.109

44、 18.117 ---- > max ar/ht 14.553 3867 0.051 ---- 18.184 ---- 14.696 1025 0.046 0.882 18.265 17:0 2OH 0.23 ECL deviates 0.011 14.788 4103 0.059 ---- 18.318 ---- 14.920 8976 0.073 0.879 18.392 TBSA 10Me18:0 1.98 ECL deviates 0.000 15.217 1678

45、0.059 ---- 18.561 ---- 15.481 5679 0.051 ---- 18.711 ---- 15.642 785 0.048 0.869 18.803 unknown 18.814 0.17 ECL deviates -0.011 15.745 2538 0.045 0.868 18.861 Sum In Feature 7 0.55 ECL deviates 0.003 19:1 w6c/.846/19cy 15.819 14402 0.051 0.867 18.903

46、19:0 CYCLO w8c 3.13 ECL deviates 0.001 Reference 0.002 15.994 1083 0.050 0.864 19.002 19:0 0.23 ECL deviates 0.002 Reference 0.003 16.474 5581 0.049 ---- 19.279 ---- 16.687 4326 0.049 0.855 19.402 20:4 w6,9,12,15c 0.93 ECL deviates 0.007 16.818 1514 0.047 -

47、 19.478 ---- 16.968 1911 0.048 ---- 19.564 ---- 17.046 1797 0.062 ---- 19.609 ---- 17.210 6054 0.048 ---- 19.704 ---- 17.327 929 0.041 0.846 19.771 20:1 w9c 0.20 ECL deviates 0.001 17.723 6009 0.049 0.840 20.000 20:0 1.27 ECL deviates

48、 0.000 Reference 0.000 18.184 3350 0.053 ---- 20.265 ---- > max rt 18.301 7851 0.085 ---- 20.333 ---- > max rt 18.452 5935 0.077 ---- 20.420 ---- > max rt ---- 17676 --- ---- ---- Summed Feature 3 4.20 16:1 w7c/15 iso 2OH 15:0 ISO 2OH/16:1w7c ---- 4504

49、8 --- ---- ---- Summed Feature 5 10.13 18:2 w6,9c/18:0 ANTE 18:0 ANTE/18:2 w6,9c ---- 2538 --- ---- ---- Summed Feature 7 0.55 un 18.846/19:1 w6c 19:1 w6c/.846/19cy ---- ----- --- ---- ---- ---- 19:0 CYCLO w10c/19w6 2.2 土壤微生物脂肪酸(PLFAs)生物标记数量和结构分析 2.2.1土壤微生物脂肪酸(PLFAs)生物标记数量和结构总体变化（1）脂肪酸(PLFAs)生物标记种类数的变化烟株生长过程中，所采集的新鲜土壤样品中各PLFAs种类和PLFAs特征峰反应值大小如表2所示。从表2可知，各处理的PLFAs种类随着生长时间而变化。不同生长期，烟草土壤中的微生物群落的PLFAs不同，但总的变化趋势一致，即；PLFAs的种类，随生育期的延长呈增加趋势。基础土样中PLFAs主要有14种（4个处理中有3个或以上存在的同一种PLFAs），第30天的土样中PLFAs达到了22种，60天后达到24种，烟叶成熟采收期则稳定地达到了34种；对于整个生育期而言，先后总共

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