橘皮多糖的提取.doc

桔子皮多糖的提取一丶实验目的（1） 学习从植物中提取多糖及多糖含量测定的方法。（2） 了解换算因子的计算并掌握标准曲线的制作。二丶仪器与药品材料：新鲜的桔子皮试剂：石油醚；无水乙醇；浓硫酸；三氯甲烷；正丁醇；标准葡萄糖溶液（0.04mg/mL)；苯酚溶液（5%）仪器：电热恒温水浴箱；电热鼓风干燥箱；高速中药粉碎机；电子天平；200分光光度计；旋转蒸发器；循环水式多用真空泵三丶实验步骤（1） 桔子皮多糖的提取过程 称取50.00g样品粉末，置于500mL圆底烧瓶中，加入500mL80%的乙醇，回流2h，脱去表面脂肪、抽滤、风干，重复1次。脱脂后的样品，在恒温水浴中热水浸提2h，过滤后.滤渣在相同条件下重复浸提1次。将两次浸提液减压过滤，去除滤渣，合并两次滤液。将合并滤液在真空旋转蒸发器中浓缩至小体积，得粗多糖。往粗多糖里加入1;1的石油醚，去色素。挥干溶剂后，用Sevag试剂(氯仿正丁醇=41)除蛋白，连续操作多次，直到完全脱除蛋白为止。在脱蛋白后的多糖溶液中加入3倍95%乙醇，沉淀用乙醇、丙酮及乙醚反复洗涤，经抽滤、真空干燥后得到精制多糖。（2）换算因子的测定 精密称取干燥至恒重的精制桔子皮多糖20 mg，置于小烧杯中，加入适量的蒸馏水，水浴加热使其溶解，冷却后转入500mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，作多糖储备液。吸取多糖储备液0.4mL 于带塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，按测定标准曲线的方法测其吸光度，按下面公式计算换算因子f 。m 为称取的多糖质量 (mg)，C为多糖中葡萄糖的质量浓度 (g/mL)，D 为多糖的稀释倍数，做平衡实验4 次，求其平均值。（3）标准曲线的制作取葡萄糖于105 干燥至恒质量，精确称取20mg，加蒸馏水溶解，定容至500mL。分别吸取0.2mL、 0.4mL、 0.6mL、 0.8mL、 1.0mL、 1.2mL、1.4mL、1.6mL 的葡萄糖标准液，置于10mL 试管中，各加水补足至2mL加入体积分数为5%的苯酚1m，摇匀，迅速滴加浓硫酸5mL静止 10 min摇匀，室温放置20min 后于490 nm测吸光度，以2.0mL 水按同样显色操作作为空白，以蒸馏水为空白，葡萄糖质量浓度C（g/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(C)作回归处理，得回归方程: A=0.0098C+ 0.063相关系数r = 0.990，n=8。（4)样品溶液中桔子皮多糖含量测定精密吸取所得样品溶液0.4 mL于带塞试管中，加蒸馏水至 2 mL，按测定标准曲线的方法测其吸光度（A），由回归方程计算样品液中葡萄糖质量浓度 (C)，按下面公式计算样品中多糖的质量分数（）。C为样品溶液中葡萄糖质量浓度(g/mL)，D为样品溶液的稀释倍数， f 为换算因子，m为称取桔子皮干粉的重量(g) 。桔子皮多糖的提取综述摘要：将桔子皮烘干，粉碎，先用80%的乙醇溶液于80回流2 个小时，除去单糖和低聚糖，再用石油醚脱脂、Sevag 法除蛋白得到浅黄色桔子皮多糖，经提纯后得到灰白色桔子皮多糖。通过正交实验法研究了浸提温度、浸提时间、料水比三因素对桔子皮多糖提取的影响。初步筛选出桔子皮多糖最佳提取条件为，料水比135，浸提温度90，浸提时间120min。用硫酸苯酚法对桔子皮多糖含量进行测定，结果表明；.桔子皮多糖换算因子为3.15，桔子皮多糖平均质量分数为2.36%，桔子皮多糖测定相对标准偏差(RSD)为2.14%。关键词：桔子皮；多糖；提取；分析 桔子皮，在我国的传统医药中又叫陈皮，系芸香科植物橘树的成熟果实之干燥果皮，味苦、辛，性温。归肺、脾经。功能理气化痰、健胃除湿、降低血压等，主要用于治疗胸腔胀满，食少吐泻，咳嗽痰多等症，因此是一种很好的中药材。桔子皮除含有多糖外，还含有大量的对人体有益的维生素B 和C，香精油，芳香油，麝香草酚等有机物。桔子皮中的多糖被制成保健品和食品着色添加剂肯定具有重要的开发价值。有关桔子皮中色素、类黄酮、果胶等物质的研究很多，而对桔子皮多糖的有关研究则少见报道。多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质，它是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物。对多糖的研究，最早是在20 世纪40 年代，但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60 年代，经过40 余年的不断发展，人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识，使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一。自20 世纪60 年代多糖的生理活性功能被发现后，有关多糖的研究日益受到世界各国的重视。近年来发现植物多糖具有抗病毒、增强免疫力、抗肿瘤、延缓衰老、降血糖、抗凝血等多种功效1，而且多糖作为药物其毒性极小。据 Franz 等2报道，已有近百种植物的多糖被分离提取鉴定出来。这类多糖来源广泛且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。所以多糖物质的研究将成为继蛋白质和核酸之后的探索生命奥秘的第三里程碑3。 目前，多糖的主要提取分离方法有水提取法、微波辅助提取法和索氏提取法。吉林大学生命科学院孟凡欣等采用了水提法提取了刺五加中的刺五加多糖4，广东省农业科学院生物技术研究所的唐小俊等也使用该技术提取了荔枝中的荔枝多糖5；微波辅助提取法是近年来发展起来的一项提取多糖的技术，国内外学者先后运用该技术提取了辣椒中的辣椒素、大蒜中的大蒜辣素、苹果中的果胶、银杏中的黄酮苷、甜菜及甘蔗中的糖分6，葡萄中糖苷类风味物质7真菌中的总脂肪酸和麦角醇8；也是一种较常用的方法，四川理工学院生物工程系的游建明采用索氏提取法提取了生姜中的生姜黄酮9。塔里木大学农业工程学院的候旭杰等采用该技术提取了野生巴楚蘑菇中的野生巴楚蘑菇多糖10。马钊发明了洋葱多糖的常规提取法11，即水提取法。这些研究表明，植物多糖的提取和研究正在向一个更为广阔的空间发展。从植物中提取多糖12，一般先用石油醚、乙醚等有机溶剂提取，除去脂溶性杂质。然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂。但获得的多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物(如低聚糖)等杂质，必须分别除去。植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深，还需对其进行脱色使其应用范围更加广泛。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)。多糖含量的测定13常采用比色法或滴定法。比色法使用历史悠久，20 世纪4050 年代就先后报道了咔唑硫酸法、蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法测定多糖含量14，目前使用最广泛的是后两种。其原理是根据多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再将其与苯酚或蒽酮缩合成有色化合物，在适当的波长和一定的浓度范围内，吸收值与糖浓度呈线性关系，从而可通过比色测定其含量。滴定法主要是采用Fehling 还原滴定法，此法是多糖水解成还原性的单糖后，以次甲基兰做指示剂，用标定过的碱性酒石酸酮溶液直接进行还原滴定，根据样液消耗的体积计算其含量。本法快速简便，不需精密仪器，对所有多糖均适用。近年来，高效液相色谱法(HPLC)越来越多地用于测量植物中的多糖，它分析速度更快，可以直接进样，不必制备成衍生物，而且有较高的分辨率。本文采用醇析水提法提取桔子皮多糖.探讨了桔子皮多糖的提取条件并对其进行了含量测定和光谱分析。参考文献.1 田庚元,冯宇澄,林颖.植物多糖的研究进展J.中国中药杂志,1995,20 (7):441.2 FRANZ G. Polysaccharides in pharmacology. Currentapplication and future conceptsJ.PlantaMed,1998,55(6):493-497.3 吴东儒主编.糖类的生物化学M.北京:高教出版社,1987.4 孟凡欣,蒋朝军,于笑坤,等.刺五加多糖的提取及含量测定J.工艺技术,2005,7:110-111.5 唐小俊,池建伟,张名位,等.荔枝多糖的提取条件及含量测定.华南师范大学学报(自然科学版)J,2005,(2):27-31.6 赵武奇, 孙萍, 刘霞, 等. 新疆党参总黄酮与多糖的微波提取及含量分析J. 中医药学刊.2004,7:1222-1225.7 Bureaus Razungles A.Baumes Retal.Glycosylated Flavor Precursor Extraction by microwaves湖南人文科技学院毕业论文.设计.10fromgrape juice and grapsJ.Journed of Food science,1996,61(3):557-561.8 Christopher J.Microwave-Assistedion of the Fungal Metabolite Ergosterl and total fattyacidesJ.Agric food cleem.1995,43(11):2904-2910.9 游见明.生姜黄酮的提取方法比较J.四川食品与发酵,2005,2:29-31.10 候旭杰, 杨保求, 张娜, 等. 野生巴楚蘑菇多糖的提取及含量测定J. 塔里木大学学报,2005,6:25-26.11 马钊,李景明,李丽珍,等.洋葱多糖提取工艺的研究J.工艺技术,2005,5,98-99.12 张晓静,刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展J.时珍国医国药,2003,14(8):495.13 黄瑞松.中草药多糖含量测定方法概述J.中国药师,2005,8(1):68-70.14 高丽君,王汉忠,崔建华,等.苯酚硫酸法测定白首乌中多糖含量J.山东农业大学学报(自然科学版),2004,35(2):295-297.