微生物学实验三和四.doc

实验三：玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌

一、目的要求
掌握玻璃器皿的清洗、包扎及干热灭菌的操作方法。

二、实验材料
玻璃器皿、烘箱、牛皮纸、纱布、纱绳

三、操作步骤
（一）清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。
1. 新玻璃器皿的洗涤方法
新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时，酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液，浸泡后用自来水冲洗干净。

2. 使用过的玻璃器皿的洗涤方法
(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。但是洗衣粉和去污粉较难冲洗干净，常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗。若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。
(2) 装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液(来苏尔)或0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤
(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5—10 min，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗。然后在稀洗涤液中浸泡0.5—2 h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%酒精中保存备用。

3. 洗涤液的配制与使用
(1)洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下:
浓溶液 重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g
自来水 150mL
浓硫酸(工业用) 800mL
稀溶液 重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g
自来水 850mL
浓硫酸(工业用) 100mL
配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。贮存于有盖容器内。
(2)原理 重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸，酪酸的氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。
(3)使用注意事项 (a)洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨液洗。如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；(b)玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；(c)此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料器皿；(d)有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；(e)盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；(f)洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。

（二）空玻璃器皿的包扎
1. 培养皿的包扎
培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5—8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。
2. 吸管的包扎
准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5 cm处，塞一小段约1.5 cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。
3. 试管和三角烧瓶等的包扎
试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸(不可用油纸)与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。
空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。

（三）干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；
1. 装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放入电热烘箱中。
2. 升温 关好电烘箱门，打开电源开关，旋功恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160—170℃)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后，则烘箱绿灯亮，表示巳停止加温。
3. 恒温 当温度升到所需温度后，维持此温度2 h。
4. 降温 切断电源，自然降温。
5. 取出灭菌物品 待电烘箱内温度降到70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。
实验四：常用培养基的配制和湿热灭菌
一、目的要求
学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、实验材料
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L H Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布

三、操作步骤
(一 )牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下:
牛肉膏3g、蛋白胨l0gNaCl 5g、琼脂15—20g、水1000mL、pH 7.4—7.6
1. 称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速
2. 加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中．需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3. 调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5. 分装：可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。
6. 加棉塞 ：棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。
7. 包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8. 灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20 min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。
9. 摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。
10. 无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h， 无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。
(二) 高氏1号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
1. 配方：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 05 g、K2SO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 1g、琼脂15—20g、水1000mL、pH 7.4—7.6
2. 称量和溶解：经计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000 mL培养基中加入以上贮备液1 mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白脏培养基配制
3. pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

(三)马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。
1. 配方：K2HPO4 1g、FeSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10 g、琼 脂15—20 g、水1000 mL、自然pH。
2. 称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1％的水溶液，在1000 mL培养液中加人以上孟加拉红溶液3.3 mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
3. 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。
4. 链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降全45℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存于—20℃)，在1000 mL培养基中加1％链霉素0.3 mL，使每毫升培养基中含链霉素30 μg。

(四) 高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。
1. 加水：将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为宜。
2. 装料：将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以免冷凝水沾湿棉塞。
3. 加压：将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀。
4. 排气：用电炉或煤气加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。 一般排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净(沸后约5min)。
5. 升压：当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。 本实验用121℃，20 min灭菌。
6. 降压：达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀，放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。
7. 无菌检查：将已灭菌培养基于37℃培养24 h，无杂菌生长，即可待用。

四、注意事项
1. 称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖：调pH时要小心操作，避免回调。
2. 不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

六、实验报告
1. 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
2. 配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
3. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理? 已灭菌的培养基如何进行无菌检查？