高效液相色谱仪(HPLC)校正方法.doc

高效液相色谱仪（HPLC）校正方法
0.1       输液系统：
0.1.1    梯度误差GC不超过±3%
0.1.2    泵流量设定值误差 Ss＜±2%
0.1.3    流量稳定性误差 SR＜±2%
0.2       紫外检测器性能
0.2.1    基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU
0.2.2    定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5%
0.2.3    最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液
0.2.4    可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成)

1          校正条件
1.1       环境温度10-30℃，相对湿度低于65%
1.2       校正设备
1.2.1    秒表 分度值小于0.1 s
1.2.2    分析天平 最大称量200g,最小分度值0.1mg
1.2.3    容量瓶
1.2.4    微量注射器
1.3       标准物质和试剂
1.3.1    HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮
1.3.2    1×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液
1.3.3    紫外波长标准溶液
2          校正方法
2.1       梯度误差GC的校正
2.1.1    进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%，20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100%
Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值
可接受标准： -3%≤Gci≤3%
2.2       泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差SR的校正
2.2.1    将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25分钟，称重，按下式计算流动相流量设定值误差Ss和流动相流量稳定性误差SR。公式：Ss=（Fm-FS）/Fs 100%
可接受标准：-2%≤Ss≤2%
SR=（Fmax-Fmin）/F×100%
可接受标准：-2%≤SR≤2%
Ss：流量设定值误差（%）； Fm=（W2- W1）/ρt.t：流量实测值（ml/min）
W2 ：容量瓶+流动相的重量（g）； W1：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）；
ρt：实验室温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）；
SR ：流量稳定性误差（%）； Fmax 为同一组测量中流量最大值（ml/min）；
Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F 为同一组测量值的算术平均值（ml/min）
表一：Ss和SR的校正
流量设定值（ml/min）
1.0
1.5
测量次数
3
3
收集流动相时间（min）
15
10
允许误差
Ss
2％
2％
SR
2％
2％
2.3       基线噪声和漂移
2.3.1    选用C18的色谱柱，以波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min，仪器稳定后记录基线30min，求基线噪声Nd。可接受标准：Nd≤5×10-4AU
2.3.2    基线漂移用1h内基线偏离原点的值（AU/h）表示。可接受标准：D≤5×10-3AU/h
2.4       最小检测浓度
2.4.1             以上述色谱条件下，进样20ul的1×10-7g/ml的萘甲醇溶液，计算最小检测浓度CL。公式：
CL=
2 Nd C×20
HV
Nd：基线噪声，mm； C：标准溶液浓度，g/ml；
H：标准溶液色谱峰的峰高，mm； V——进样体积，ul。
2.4.2             可接受标准：CL≤1×10-7g/ml
2.5       定量测定重复性的校正
将仪器联接好，使之处于正常工作状态，波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min,用萘的甲醇溶液连续进样6次记录下峰面积，按下式计算相对标准偏差：
n
RSD = [∑（Xi- X ）2]/（n-1）×(1/ X )×100%
I=1
RSD：相对标准偏差（%）； n：测量次数； Xi：第I次测量的峰面积
X – n次进样的峰面积算术平均值
可接受标准：RSD≤1.5%
2.6       波长示值误差
2.6.1             用注射器将紫外波长标准溶液（标准波长为235nm，257nm，313nm和350nm）从检测器入口注入样品池冲洗，并将池充满，将波长调到低于标准波长5nm处，到标准波长+4nm处，测得的最大吸收值处对应的波长与标准波长之差为波长示值误差；目前仪器可以在1ml/min的流量下，直接用空管连接检测器，每隔2min改变1nm，连续进标准样10ul，同样可得波长示值误差。
2.6.2    可调波长紫外可见光检测器波长示值误差 (此项只适用于HP1100高效液相色谱仪且带有HP工作站)。
2.6.3    打开HP1100液相色谱仪和HP工作站，打开输液泵和检测器，用纯水冲洗系统直至稳定，进入 Diagnosis窗口，点击氘灯图标，进入 show module tests状态，点击VWD VL calibration test 点击start ，系统自动进入校正状态，待校正完毕，将校正结果打印归档。
2.6.4    可接受标准：λ≤2nm
3                    性能确认
3.1       使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；
3.2       先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。
3.3       液相色谱柱的确认
3.3.1    测试标准样配制：称量1000mg苯酚，100mg联苯加入到100ml容量瓶中，移入邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯各1ml，然后用甲醇定容到100ml，混匀，从中移取1ml该溶液，用乙腈：水=70：30定容至100ml。
3.3.2    方法：流动相为乙腈：水=70：30，流速为1.0ml/min,波长为254nm,温度为30℃，进样量为：10ul,运行10min。
3.3.3    色谱柱：Extend-C18 Analytical, 5um,4.6*250mm。
3.3.4             连续进行5次分析，分离度均R＞1.5；邻苯二甲酸二乙酯对称因子S在0.80～1.50范围内；邻苯二甲酸二乙酯柱效＞3000m-1；邻苯二甲酸二乙酯峰面积的标准偏差应≤1.5%。
3.4       按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图； 根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。
4                    校正结果处理和校正周期
4.1       校正结果全部项目均符合技术要求者，判为合格，方可使用。若某些指标达不到要求，关于仪器情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。
液相色谱仪的校正周期为一年。