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1、1我报告的题目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀/多肽复合焚光探针用于蛋白激酶活性及抑制作用分析 2蛋白激酶催化作用下的蛋白质憐酸化是生物体内翻译后修饰的重要方式之一。蛋白质的憐酸化和去磷酸化这一可逆过程几调节着细胞的发育、增殖、分化、信号转导、神经活动、肌肉收缩、细胞凋亡及肿瘤发生等过程在内的大部分生命活动。非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病,例如癌症或老年痴呆症等。因此,准确灵敏地检测过度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄选高效抑制剂对于人类一些重大疾病的早期诊断和治疗极为重要。 传统用于蛋白激酶活性分析的方法依赖于放射性元素标记伽马-32P-ATP法,由于放射性物质对环境及其人体的危
2、害而随之被取代,基于憐酸特异性识别抗体的免疫技术[146]、突光分析方法表面等离子共振技术[184,185]以及质谱等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。 石墨稀(Graphene),是从石墨材料中剥离出来的由碳原子组成的二维晶体, 是目前己知世界上强度最高的材料。石墨稀具有独特的电子、机械、热力学特性 在化学、质量、压力等传感应用中独具优势,。与碳纳米管相似,石墨烯对有机 荧光分子表现了有效的突光淬灭效果,这一过程中同时发生了激发态突光分子与 石墨烯表面之间的能量转移和电子转移。2010年诺贝尔物理学奖 氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，氧化石墨烯是单一的原子层，仍然
3、具有淬灭荧光的效果 3本文首次提出了一种基于多肽/石墨烯突光浮灭机制和接肽酶降解作用的激 酶活性分析方法。酪蛋白激酶CKII是一种重要的丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶, 能磷酸化160种不同的蛋白质,我们以CKII为蛋白激酶模型 。FITC 标记的 CKII底物多肽,FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD),能与GO发生有效的突光浮灭。幾肽酶CPY是一类 肽链端解酶,作用于任何一个C-末端残基,从肽链的C端开始逐个降解,释放出 游离氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下释放出游离的FITC分子,在 高离子强度环境下,游离FITC分子与GO之间的吸
4、附较小而保持相当强的焚光。 而当FITC-peptide在CKII/ATP催化发生磷酸化,有效地阻碍CPY在憐酸化丝氨 酸位点的降解,使得FITC-多肽更容易与GO结合导致焚光淬灭。 1羧肽酶CPY 作用于任何一个C-末端残基 逐个降解释放游离氨基酸，并释放出游离的FITC分子，在高离子强度环境下(猜想，故而加了氯化镁和钾)，与GO之间吸附较小保持相当强的荧光 4. 梭肽酶(carboxypeptidase Y, CPY)、Staurosporine、弗斯可林(Fskorlin)和 3-异丁基-1-甲基黄嘿呤(IBMX) 购买于西格玛公司(中国上海)。cAMP-依赖型蛋白激酶(P
5、KA,催化亚基)购买 于Promega公司,酷蛋白激酶II (CKII)购买于New England Biolabs公司(美国)。 突光素标记底物多肽:FITC-RRRADDSDDDDD ( FITC-pep )、 FITC-RRRADDpSDDDDD (FITC-Ppep)和 FITC-LRRASLG (FITC-kemptide) ATP、蛋白酶抑制剂和改良型Bradford蛋白总浓度检测试剂盒 牛血清蛋白(BSA)、三轻甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、 EDTASynergy Mx酶标仪(BioTek仪器有限公司)进行突光光谱分析,所有样 品用480 nm作为激发波长
6、从500 nm到700 nm (25 °C)扫描焚光发射谱图。 5氧化石墨稀与多肽FITC-pep之间的劳光淬灭（氧化石墨烯对荧光强度的影响）FlTC-peptide+ TBS+ Tris-HCl+ MgCb+ KCl+氧化石墨稀 在96孔酶标板中加入60 nL浓度为的多肽(FlTC-peptide)溶液(溶 于 TBS,即 20 mM Tris-HCl,10 mM MgCb, 50 mM KCl, pH 7.5),每孔中加入 5 pL氧化石墨稀(浓度40 |ig ml/i),设定酶标仪混勻1 min,在480 nm激发下 扫描500 nm至700 nm的突光发射光谱。考察氧化石墨
7、烯的浓度因素时,加入石 墨稀的浓度依次为 0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mU'), 酶标仪设定程序同上。考察FITC-peptide的多肽片段对氧化石墨稀的亲和力时, 用游离的突光素FITC分子作为参照,与石墨稀在酶标板中混勻1 min后进行劳光 检测,程序同上。 6氧化石墨稀(GO)与多肽之间通过亲疏水性、电子共辄、电荷吸附等发生 相互作用。氧化石墨稀(GO)含有亲水性的离子化边缘和疏水性的中间片层因而 具有两亲性,当突光染料标记的多肽与石墨烯共存时,由于亲疏水作用、电荷吸 附等作用而导致多肽结合在GO表面,荧光染料分子与GO发生较强的能量
8、转移 而导致焚光萍灭。当增加GO的浓度,FITC-peptide在520 nm处的焚光强度随之剧烈降低,GO浓度为50 lag ml/i时,FITC-peptide劳光强度与 萍灭之前相比,下降至15%,萍灭程度非常高。而游离的FITC分子在与GO混 合之后,随着GO浓度的增加,FITC突光分子的焚光强度没有很明显的下降,当 GO浓度为50 i^g mL"'时,FITC分子的突光仍保持了 90%,这说明GO对 FITC-peptide突光浮灭作用要远远大于游离的FITC分子,同时多肽片段因为能很 好的与GO结合,导致了 FITC更易于GO接近,发生电子传递的劳光浮灭 7羧肽酶消化
9、多肽底物（CPY浓度对荧光强度影响） 100^lL浓度为10|iM的多肽(FITC-peptide)溶液中,加入3.29 U mL/i的接 肽酶CPY,恒温25。(:孵育30 min,取反应液60 ^iL与氧化石墨稀(浓度40 ^ig ml/i) 在酶标板中混勻1 min后进行劳光检测,程序同上。考察梭肽酶CPY对憐酸化多 肽(FITC-Ppep)的消化作用时,釆用同样浓度的FITC-Ppep多肽(10 ^M)与 CPY作用,然后与石墨稀混合测突光发射光谱。考察接肽酶CPY对此浓度的多 肽的消化所需量时,在多肽溶液中加入CPY的浓度为:0-13.16UmL人其余条 件一致。FIT
10、C-peptide/FITC-Ppep+CPY+氧化石墨稀+其余条件 8检测PKA活性和抑制作用（研究不同激酶活性，激酶浓度的影响。CKII中加抑制剂浓度的影响）蛋白激酶CKII催化的憐酸化反应条件为:含有10^iM多肽(FITC-pep)、0.1 mMATP、10 U CKII、20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCb, 50 mM KCl 的反应混合 液(pH7.5)在恒温30 °C反应1小时。蛋白激酶PKA催化的磷酸化反应条件为: 10^1肘多肽(FITC-kemptide)、0.1 mMATP、10 U PKA、50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCh
11、的反应混合液(pH7.5)在恒温30 °C反应1小时。激酶催化憐酸化反应完 成后,取100 反应混合溶液,加入3.29 U 的接肽酶CPY,恒温25 °C孵 育30 min,再取60 |iL CPY消化后的反应液与氧化石墨烯(浓度40 |_ig ml/i)在 酶标板中混匀1 min后进行突光检测,程序同上。 分析蛋白激酶CKII的活性实验中,120 ^;!^憐酸化反应液中加入不同浓度的 激酶,即0-100 U。考察Staurosporine或H-89对激酶CKII的抑制效果时,在激 酶催化磷酸化反应时,加入lOUCKII,同时加入不同浓度的Staurosporine (0 - 20
12、 I^M)或 H-89 (0 - 0.2 mM). 9了两种广谱小分子抑制剂:Staurosporine、 H-89来进行考察。在CKII催化憐酸化反应缓冲液中,加入一系列浓度的激酶抑 制剂Staurosporine或H-89,反应完成后,加入CPY消化,然后与GO结合之后 检测突光强度,实验结果见图5.12。如图5.12A所示,随着Staurosporine浓度的 增加(0 - 20 ^M),多肽/GO复合物的突光依次增加,这表明Staurosporine对激 酶CKII活性有很好的抑制作用,当Staurosporine的浓度达5 |aM时,抑制作用达 到最强。从焚光强度对S
13、taurosporine浓度的对数关系图得到Staurosporine的抑制 曲线,可以估算出Staurosporine对CKII的ICso值(最大抑制的50%对应的浓度) 为94nM,这与以往文献报道值接近[2°4]。另一方面,H-89对CKII活性的抑制作 用在图5.12B中体现,在激酶催化憐酸化反应中,改变抑制剂H-89的浓度(0 - 200 HM),随着H-89浓度旳增加,多肽/GO复合物的焚光强度也依次增加,这表明生物纳米材料构建蛋白激酶活性传感与蛋白质直接电化学 H-89对激酶CKII催化反应的抑制,相应的憐酸化水平逐步降低。通过焚光强度 对H-89浓度对数关系作图,得
14、到H-89的抑制曲线。可以估算出H-89对CKII的 IC50值是1.18 laM,这与以往文献中报道值相当比较Staurosporine和H-89 对CKII活性的抑制作用结果,我们发现两种小分子抑制剂对CKII的抑制能力是 不一样的,Staurosporine的ICso值要明显小于H-89的,这说明Staurosporine的 抑制能力更强。因此,上述结果证实了我们提出的这种基于CPY消化作用及GO 突光萍灭作用的激酶活性分析方法,不仅能有效检测小分子抑制剂,而且能用于 蹄选激酶抑制剂。 10MCF-7细胞培养和裂解液的准备 MCF-7细胞（一种乳腺癌细胞）(1 X 105
15、个细胞)培养在含有10%的胎牛血清,转录非必需氨基酸溶液(0.1 mM), 1%胰岛素-转铁因子-硒补充剂,青霉素(lOOUml/i),链霉 素(100mgmL_i),两性霉素B (0.25 mgrnL"')的培养液中。细胞在包含5%C02 的湿度氛围中孵育(37 °C)。用无血清培养基(ImL)代替细胞培养基在刺激之 前培养4小时,培养基中加入用二甲基亚砜(DMSO)配制的不同浓度的 Fosklin/IBMX（抑制细胞增殖）混合液(lOpL,Fosklin/IBMX最终浓度在图6A插图中显示)来激活细胞内的PKA。DMSO (10 laL)代替Fosklin/IBMX添加到培养基作为
16、未激活 样品。激活30分钟后,将细胞转移至憐酸盐缓冲液(D-PBS)中,通过超声(200 W)2秒X60次,每次间隔3秒钟的方法超声破碎细胞。再将细胞裂解液在转速 22 000 rpm^ 4。C下离心60分钟,取上清液备用。 使用改良型Bradford总蛋白浓度试剂盒来估算细胞裂解液的总蛋白浓度,其 用牛血清蛋白(BSA)作为标准。不同浓度的BSA标准溶液(5-30|agniI/i)和 Bradford反应物孵育10分钟,用紫外-可见光谱得到该溶液在595 nm的吸光度, 标准浓度对吸光度的校正曲线通过线性关系得到。最后,将细胞提取物与Bradford 反应试剂混合,用上述提到
17、的方法检测。总蛋白浓度通过参照标准曲线计算。所 有细胞裂解液的总蛋白浓度稀释为8 ml/i用于激酶活性实验 11。FITC-多肽的突光萍灭程度用(Po-PyPo 来计算,/>0为FITC-多肽与GO结合之前的焚光强度,P为FITC-多肽与GO结合 后的突光强度。如图5.14所示,FITC-kemptide在1号裂解样品参与的憐酸化下, 经CPY消化和GO的结合后,表现的突光萍灭程度最低((Po-P)/PQ = 0.52),随 着激活剂Foskolin/IBMX浓度的增加,FITC-多肽/GO复合物的突光浮灭程度依次增加,当浓度增加至第5号样品浓度值时(Ci:sk= 10 |iM,C
18、ibmx = 20 ^iM),突光 浮灭程度达到最大((P()-P)/P() = 0.84),而再增加激活剂浓度,相应的劳光淬灭程 度反而有所下降。因此,我们提出的基于接肽酶CPY消化作用与氧化石墨稀突光 萍灭效应的蛋白激酶活性分析方法,能有效检测MCF-7细胞裂解液中激活PKA 的活性,拓宽了此种分析方法在分析检测中的应用 而CKII/ATP催化磷酸化后，有效组织CPY在磷酸化丝氨酸位点降解，使得FITC-多肽容易与GO结合导致荧光淬灭 酪蛋白激酶CKII催化肽链中邻近酸性氨基酸残基的丝氨酸/苏氨酸磷酸化的酶 FITC标记Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非
19、离子型表面活性剂（或称去污剂） staurosporine蛋白激酶C(PKC)抑制剂 H-89也称H89，全称为N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate，是一种常用的PKA抑制剂。H-89可以通透细胞，可以选择性抑制cAMP、cGMP依赖的蛋白激酶PKA、PKG和PKCμ，但对于PKA的选择性抑制作用更强。 H-89分子量为519.28，分子式为C20H20BrN3O2S·2HCl，CAS Number：127243-85-0。本产品纯度大于98%。 CKII酪蛋白激酶
20、II 蛋白激酶C(PKC)是动物细胞内信号转导中重要的酶. 它是一族磷脂依赖的丝/苏氨酸激酶, Foskin弗斯可林：毛喉鞘蕊花中所含的佛司可林为目前已知的最强的腺苷酸环化酶激活剂，能够直接激动腺苷酸环化酶，提高多种组织细胞中的环腺苷酸的浓度，从而参与多种细胞功能调节，它还是人体形成重要激素过程中不可缺少的部分。通过弗斯可林的作用可以降低血压，抑制过敏性反应，以及能够促进甲状腺素的分泌。弗斯可林的其他功效同样显著，包括抑制象由血小板激活因子（PAF）6引起的炎症以及抑制癌细胞的扩散。 IBMX, 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤: cAMP 和 cGMP 磷酸二脂酶的非专一性抑制剂。IBMX
21、抑制了磷酸二脂酶，cAMP的增加激活了PKA蛋白激酶A（英语：Protein kinase A），一类cAMP-依赖型酶 ，其结果是减少增殖，增加分化和诱发凋亡. IBMX抑制由苯肾上腺素诱导的色胺（来自于神经内分泌上皮细胞的减少粘液IC50: 1.3 μM）的减少 。也作为腺苷受体拮抗剂。------IBMX抑制cAMP间接抑制PKA 肯普肽；英文名称：kemptide因发现者肯普(Kemp)而得名。S6激酶的底物肽(LRRASLG)，可被磷酸化。 C32H61 N13 O9 Tris 氨基丁三醇为弱碱，在25℃下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7
22、0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响。 DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度>99%。 常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。 在散布图中，通常还要用误差棒（error bar）注明所测量数据的不确定度的大小。 误差棒是以被测量的算
23、术平均值为中点，在表示测量值大小的方向上画出的一个线段，线段长度的一半等于（标准或扩展）不确定度。它表示被测量以某一概率（68%或95%）落在棒上。图1表示不同时期几个单位对牛顿万有引力常数的测量结果，最下面的一个数据是国际科学技术委员会 2002年给出的推荐值。 SynergyMx多功能酶标仪 SynergyTM Mx多功能微孔板检测系统，拥有独特的Fine-TunedTM 技术，在微孔板检测领域独树一帜。 SynergyTM Mx 采用四光栅系统进行波长的选择，其波长重复性可精确到±0.2nm，顶部探头可以100μm的步进精度自动精准聚焦。SynergyTM Mx的荧光检测采用了独特的
24、带宽设计，激发和发射侧均可独立进行4种不同带宽的选择，可以有多达16种的带宽组合满足不同荧光染料的检测要求。SynergyTM Mx专利的4-Zone™温控系统是目前最先进的技术，高达65℃的孵育温度满足所有温控实验要求，在37℃时其温度准确性为±0.5℃。以上这些独到的设计以及BioTek公司在微孔板检测系统和应用软件上所具有的高度专注，使得Synergy Mx成为当今生命科学研究领域拥有最好精确 度、灵敏度和灵活性的多功能微孔板检测系统。 TBS（叔丁基二甲基硅烷） 单位 u/L表示在每升有多少u,这个是属于一种剂量的单位,是需要根据检查的种类来做使用的.无确定值，因物而异 MCF-7:人乳腺癌细胞系两性霉素B：链霉菌(Streptomycesnodosus)的培养液中分离而得的一类多烯类抗真菌药。 光致發光（Photoluminescence,簡稱PL） 是指物質吸收光子（或電磁波）後重新輻射出光子（或電磁波）的過程。從量子力學理論上，這一過程可以描述為物質吸收光子躍遷到較高能級的激發態後返回低能態，同時放出光子的過程。光致發光是多種形式的螢光（Fluorescence）中的一種。 EC50，半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect,EC50）是指能引起50%最大效应的浓度
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