显微镜成像质量.doc

影响显微镜成像的关键因素-像差

由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的像，各种像差的存在影响了成像质量。所谓像差（aberration），是指测量显微镜或者体视显微镜透镜或反射镜所呈的像与原物面貌并非完全相同的现象。像差又可以分为几类，例如球面像差是由于一点光源发散的光线被分聚在不同的点上的缘故。色彩像差的原因是透镜的折光指数随光波的长短而变化，从而引起像的边缘呈现色彩。可以理解为实际像与根据单透镜理论确定的理想像的偏离，这些偏离是折射定律造成的。像差是由透镜对色光的不同弯曲能力所致，并造成带有色晕的像。与色无关的像差（“单色像差”）包括使像变形的像差（“畸变”、“场曲”）和使像模糊的像差（“球差”、“彗差”、“散光”）。 像差在金相显微镜、数码CCD、生物显微镜和其他光学显微镜中可以通过透镜的组合减小到最低限度。镜面也有与透镜一样的单色像差，但没有像差。
色差（Chromatic aberration）
色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。显微镜光学系统最主要的功能就是消色差。
球差（Spherical aberration）
球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。

球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。现一般生物显微镜、工业显微镜包括体视显微镜的球差完全由物镜消除。
慧差（Coma）
慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点状，型如慧星，故称“慧差”。使用轴向平行光可以消除慧差。

像散（Astigmatism）
像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。

场曲（Curvature of field）
场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个像面，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜（包括奥林巴斯显微镜、尼康显微镜、蔡司显微镜等系列）一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。

畸变（Distortion）
前面所说各种像差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的像差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真。

（1） 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；
（2） 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像；
（3） 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像；
（4） 当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；
（5） 当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像。
显微镜的成像原理就是利用上述（3）和（5）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F（F为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距F1之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）人眼的明视距离（250mm）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像与原物体的像，方向相反。 
如今的显微镜在物镜设计上已经逐步设计出了平场消色差物镜、半复消色差物镜、甚至全复物镜，对于显微镜成像质量给了很好的保证

影响显微成像质量的因素--显微镜镜头

显微镜镜头分不同类型，但即使对于同一类型的镜头，其成像质量也有着很大的差异，这主要是由于材质、加工精度和镜片结构的不同等因素造成的，同时也导致不同档次的镜头价格从几百元到几万元的巨大差异。比较著名的如四片三组式天塞镜头、六片四组式双高斯镜头。对于镜头设计及生产厂家，一般用光学传递函数OTF(Optical Transfer Function)来综合评价镜头成像质量，光学系统传递的是亮度沿空间分布的信息，光学系统在传递被摄景物信息时，被传递之各空间频率的正弦波信号，其调制度和位相在成实际像时的变化，均为空间频率的函数，此函数称为光学传递函数。OTF一般由调制传递函数MTF(Modulation Transfer Function)与位相传递函数PTF(Phase Transfer Function )两部分组成。像差是影响图像质量的重要方面，常见的像差有如下六种：
球差:
由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于主轴上的同一位置，以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散光斑(俗称模糊圈)，则此光学系统的成像误差称为球差。
慧差:
由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若在理想像平面处不能结成清晰点，而是结成拖着明亮尾巴的慧星形光斑，则此光学系统的成像误差称为慧差。
像散:
由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的斜射单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，不能结成一个清晰像点，而只能结成一弥散光斑，则此光学系统的成像误差称为像散。
场曲:
垂直于主轴的平面物体经光学系统所结成的清晰影像，若不在一垂直于主轴的像平面内，而在一以主轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则此光学系统的成像误差称为场曲。当调焦至画面中央处的影像清晰时，画面四周的影像模糊;而当调焦至画面四周处的影像清晰时，画面中央处的影像又开始模糊。
色差:
由白色物体向光学系统发出一束白光，经光学系统折射后，各色光不能会聚于一点上，而形成一彩色像斑，称为色差。色差产生的原因是同一光学玻璃对不同波长的光线的折射率不同，短波光折射率大，长波光折射率小。
畸变：
被摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。畸变像差只影响影像的几何形状，而不影响影像的清晰度。这是畸变与球差、慧差、像散、场曲之间的根本区别。
我们在评价镜头质量时一般还会从分辨率、明锐度和景深等几个实用参数判断。
分辨率：
又称鉴别率、解像力，指镜头清晰分辨被摄景物纤维细节的能力，制约镜头分辨率的原因是光的衍射现象，即衍射光斑(爱里斑)。分辨率的单位是线对/毫米。
明锐度(Acutance)：
也称对比度，是指图像中最亮和最暗的部分的对比度。
景深(DOF)：
在景物空间中，位于调焦物平面前后一定距离内的景物，还能够结成相对清晰的影像。上述位于调焦物平面前后的能结成相对清晰影像的景物间之纵深距离，也就是能在实际像平面上获得相对清晰影像的景物空间深度范围，称为景深。
最大相对孔径与光圈系数：
相对孔径，是指该镜头的入射光孔直径(用D表示)与焦距(用f表示)之比，即：相对孔径=D/ f 。相对孔径的倒数称为光圈系数(aperture scale)，又称为f/制光圈系数或光孔号码。一般镜头的相对孔径是可以调节的，其最大相对孔径或光圈系数往往标示在镜头上，如1:1.2或f/1.2 。如果拍摄现场的光线较暗或曝光时间很短，则需要尽量选择最大相对孔径较大的镜头。
镜头各参数间的相互影响关系
一个好的镜头，在分辨率、明锐度、景深等方面都有很好的体现，对各种像差的校正也比较好，但同时其价格也会几倍甚至上百倍的提高。如果我们掌握一些规律和经验，就可以使用同档次的镜头达到更好的效果。
1. 焦距大小的影响情况
焦距越小，景深越大;
焦距越小，畸变越大;
焦距越小，渐晕现象越严重，使像差边缘的照度降低;
2. 光圈大小的影响情况光圈越大，图像亮度越高;
光圈越大，景深越小;
光圈越大，分辨率越高;
3. 场中央与边缘
一般像场中心较边缘分辨率高
一般像场中心较边缘光场照度高
4. 光波长度的影响
在相同的摄像机及镜头参数条件下，照明光源的光波波长越短，得到的图像的分辨力越高。所以在需要精密尺寸及位置测量的视觉系统中，尽量采用短波长的单色光作为照明光源，对提高系统精度有很大的作用。

********************************************************
（1）显微镜的主要性能
①分辨力：也称分辨本领，是指区分两个物点之间的最小距离的能力。能把两点分辨开的最小距离叫分辨距离。分辨距离越小，则分辨力越高；相反则低，所以，分辨力以分辨距离来表示。一般肉眼的分辨距离为0.25mm左右，所以比这个距离小的两点会被误看成一点。显微镜也有它的分辨距离和分辨力，这是显微镜性能中最重要的指标，它主要由物镜性能所决定。显微镜的分辨距离跟照明光的波长和物镜镜口率有关，可以用如下公式表示：
分辨距离（R）＝0.61λ/ N·A
λ：照明光波长 N·A：物镜镜口率
从上式可见：照明光波越短，物镜镜口率越大分辨力越高。一般可见光的彼长范围为400～700nm，若使用镜口率为1.25油镜，用可见光中最短波长的紫色光，则分辨距离约为0.2μm，这是一般光学显微镜分辨力极限。用高速电子束（其波长短到0.005nm）作为电子显微镜照明，分辨力可达0.2nm左右。比光学显微镜分辨力提高1000倍。
②镜像亮度：镜像亮度与物镜镜口率平方成正比，与总放大倍数成反比，即镜口率越大，镜像亮度越大；总放大倍数越高，镜像亮度越小。所以，总放大倍敢相同情况下，要使镜像亮度增加，就应使用镜口率的物镜与低倍目镜配合。例如：总放大倍数都是200倍，则用镜口率为0.65的40×物镜与5×目镜配合，其镜像亮度比使用镜口率为0.25的10×物镜与20 ×目镜的镜像亮度高6.75倍。因目镜放大倍数过大，得到的放大虚像很不清晰。
③ 视野宽度：目镇光柱所围绕的圆即视野宽度，视野宽度越大，观察标本的面积越大，则显微镜放大倍数越小。所以，视野宽度与放大率成反比。因此，当将低借物镜转换成高倍物镜时，必须先把标本移到视野正中央。否则玻片标本的影像会落到缩小视野的外面。
④ 清晰度：清晰度是指显微镜能形成明显物像的能力，影响物像清晰度的主要是物镜，由于照明光的光谱不同，造成色差和透镜本身球面像差。放大倍数越高，像差越大，像就越模糊。