膜片钳技术试题.doc

2010级硕士研究生膜片钳技术试题

请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后一周内交于先知楼20楼2001室陆巍老师处，过期不侯！

问答题（共100分）
1、 什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？
膜片钳技术是一种能够记录膜结构中单一的离子通道蛋白质的开放和关闭的技术，即是测量单通道离子电流和电导的技术。基本工作原理：膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞，形成吉欧姆(GΩ)阻抗，使得与电极尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。
2、 膜片钳实验的基本操作步骤包括哪些？
1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。
2.标本制备
3.记录
4、资料分析：
（1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发（Burst）样开放与闪动样短暂关闭（flickering）），化学门控性通道的开、关速率常数等。（3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。（4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最后结论。

3、 膜片钳技术的应用范围有哪些？
1） 分辨单通道电流，直接观察通道的开闭过程。
2） 区分离子通道的离子选择性及其门控性（如区分电压或化学门控性通道），发现新的离子通道及亚型。
3） 在记录单个通道电流（i）和全细胞电流（I）的基础上，可分别计算出细胞膜上的通道数（n）和开放概率（p），依公式I=nip。
4） 用以检测某些递质能否打开通道，或是否接受第二信使的调控（膜内面向外式）
5） 研究细胞膜上的信使物质对离子通道型受体的调节机制（应用全细胞记录式）
6） 研究不同离子对通道特性的影响及细胞内信使物质如对离子通道型受体的调节机制（内面向外膜片）
7） 研究药物对电压或化学门控性通道的影响。
4、 膜片钳记录方法分为哪四类？各有何特点？
膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached）
2.全细胞模式（whole -cell recording）
3.内面向外式（inside-out）
4.外面向外式（outside-out）
类型
用途
优点
缺点
细胞贴附式
单通道记录
细胞内膜生理功能完好 易测
精确电位未知，不易灌流
外面向外式
单通道记录
细胞膜的外侧面暴露在灌流液中,可以研究细胞膜外侧受体控制的离子通道
胞浆内成分受影响
细胞骨架结构破坏
内面向外式
单通道记录
细胞的内表面暴露在灌流液中,可以通过改变细胞外液成分观察对离子通道的影响
外液替代细胞内溶液相对困难
细胞骨架结构破坏
全细胞模式
整个细胞膜的电流
宏观的跨膜离子流记录
胞浆内成分受影响

5、 建立膜片钳记录系统大致需要哪些基本设备？

膜片钳实验仪器设备主要有放大器、微型操纵器（微超）、倒置显微镜、防震台、屏蔽笼、灌流槽和数据采集和处理设（计算机）。其中膜片钳放大器（amplifier）、微型操纵器（微操micromanipulator）、倒置显微镜(inverted microscope)是膜片钳实验区别于一般电生理实验所需要的仪器。

6、 传统的全细胞膜片钳记录（conventional whole-cell patch clamp recording）过程中怎样进行质量控制？
Quality control质量控制
1. The starting seal resistance must be better than 1 G;1、开始封接的电阻必须大于1兆欧。
2. The series resistance must be lower than 20 M and stay that way throughout the recording;整个记录过程中，电阻必须低于20M。
3. The membrane potential must be more negative than 50 mV if normal high-potassium intracellular solution is used;，如果在正常高钾溶液内使用，膜电位必须低于-50mV。
4. Cell capacitance and resistance must be stable. 细胞的电容和电阻必须是稳定的

7、 使用打孔全细胞膜片钳记录（perforated whole-cell patch clamp recording）的优点是什么？
打孔全细胞记录的优点：
1）克服了细胞内微电极高阻抗，需刺破细胞膜进入细胞，造成胞浆流失，破坏细胞生理功能完整性的缺点，记录是在一个相对完整的神经结构上进行；
2）电极以一个低电阻进入细胞内，这样就可以较好的控制膜电位，另外由于电极与细胞膜形成的高阻封接，这就可较好地显示细胞固有的膜特性；
3）由于电极尖端比较大，很易改变电极内溶液，以便控制细胞内环境，很易注入一些蛋白或酶至细胞内。
4）用一般常规微电极很难在比较小，年幼的神经元上作记录，而全细胞记录适合研究各种 神经制备，各种类型的神经元。

8、 如何判断膜片钳记录过程中已经形成良好的细胞封接？
在电极入液之前，给它施加一个较大的正压，有助于迅速形成良好的封接。电极入液后，液接电阻可以不补偿，当封接形成之后自然会消失。
电极刚入水时测试脉冲所引起的电流呈方波，其幅度与电极电阻成反比。电极尖端轻微触压细胞膜，电阻略有增大，噪声略有降低。形成封接后，电流方波几乎消失，噪声也急剧下降，两个尖峰是快电容引起的电流。
为证实封接的形成，可以增加放大器的增益，从而可以观察到除脉冲电压的首尾两端出现电容性脉冲尖端电流之外，电流波形仍呈平坦状。

9、 膜片钳实验的主要影响因素是什么？
减少噪音，避免电极前端的污染，封接的成功与否，选取正确的记录模式，如何选择电极内、外液，如何选择激动剂、阻断剂，正确的进行数据采集