中药质量控制与质量评价.doc

中药质量控制与质量评价
一：中药的有效成分
上现代研究结果证明中药的有效成分主要是生物碱、黄酮苷类、酚类、甾醇、蒽酮、木脂素、有机酸、氨基酸、多糖、蛋白质、多肽酶、以及挥发油萜类。至今为止研究的主要对象集中在生物碱、皂苷、黄酮、多糖类成分的研究上
二：中药有效成分的提取
药物的粉碎可用超微粉碎技术。
1 中药有效成分传统的提取方法
1.1 浸渍法
浸溃法:它是最常见的简便浸出方法。除特别规定外,浸渍法一般在常温下进行。其最适用于有效成分遇热挥发或易被破坏的药材。缺点是操作时间长, 且往往不易完全浸出有效成分。
1.2 渗漉法
是用流动的溶媒渗过药粉而进行提取。由于随时保持相当的浓度差,故提取效率高,浸出液较澄清,缺点是溶剂消耗量大,费时,操作麻烦。
1.3 煎煮法
煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。此法简便易行,能煎出大部分有效成分,但煎出液中杂志较多,且容易发生霉变,一些不耐热挥发性成分易损失。
1.4 回流提取法
在应用乙醇等易挥发的有机溶媒时,为减少溶媒消耗,提高浸出效率而采用回流热浸法。循环回流热浸法则是采用少量溶媒,通过连续回流进行提取。在回流时要加热,故对受热易破坏成分不适用,且溶
剂耗量仍大,操作麻烦
1.5 连续提取法
连续提取法是实验室做中药有效成分分析时用有机溶剂提取中
常用的方法,通常用脂肪提取器或称索氏提取器来完成。这种提取法,需用溶剂量较少,提取成分也少,但一般需数小时才能完成,所以遇
热不稳定易变化的中药成分不宜采用此法。
2 中药有效成分提取新技术分析
2.1 微波萃取技术
微波萃取技术的原理就是利用不同组分吸收微波能力的差异,使基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被萃取物质从基体或体系中分离,进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中,并达到较高的产率。微波提取技术也具有局限性:(1)富含挥发性或热敏性成分的中药材以及富含淀粉或树胶的天然植物不适合微波干燥。(2)微波处理具有一定的选择性。微波干燥要求被处理的物质具有良好的吸水性。
2.2 吸附分离技术
吸附分离的方法灵活,设备简单,运行成本低。因此,我国大规模生产的天然产物甜菊苷和银杏叶提取物均采用了树脂吸附分离法。从机理上说, 非水吸附应包括静电吸附、氢键吸附、络合吸附等。非水吸附在中药成分的提取分离中虽然刚刚开始研究,但已显示出良
好的应用前景。
2.3 超声提取法
原理: 超声波萃取简称UE，是利用超声波振动产生并传递强大的能量，并在提取介质中产生的强烈空化效应、扰动效应、高加速度、击碎和搅拌等作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，同时产生瞬时高温和极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体瞬间破裂，加速植物有效成分溶出，促进萃取的进行，提高提取效率[1-2]。超声波次级效应，如：机械震动、乳化、扩散、击碎等，也能加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。
超声波提取法在实验室中已成功地应用于皂苷类、生物碱类、黄酮类、蒽醌类、有机酸类及多糖类等成分的提取。超声波提取法无须加热,且提取时间短,提取率高,可以作为实验室和大生产的模拟工艺。但是超声波提取对容器壁的厚薄及容器放置位置要求较高,否则会影响药材浸出效果,而且超声波发生器工作噪音比较大,所以工业应用有一定的困难,这些问题都有待于进一步解决。
2.4 超临界流体提取法
超临界流体提取法是利用超临界状态下的流体所具有的高密度、低粘度等特征提取中药有效成分,然后通过降压的方法,将溶剂与溶质相分开,具有萃取和蒸馏双重作用。由于CO2本身无毒无腐蚀性,临界条件适中,故成为超临界流体提取法中最常用的超临界流体。
2.5 半仿生提取法
半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合,从生物药剂学的角度,模拟口服给药及药物经胃肠转运的原理,将药料先用一定pH 的酸水提取,继以一定pH 的碱水提取,提取液分别过滤、浓缩,制成制剂。半仿生提取法能体现中医临床用药综合作用的特点,符合口服给药经胃肠道转运吸收的原理,且在提取过程中,不经乙醇处理,可以提取和保留更多的有效成分,缩短生产周期。但目前这种提取方法仍沿袭高温煎煮法,长时间高温煎煮会影响许多有效成分,降低药效。
2.6 超滤技术(膜分离技术)
超滤是以多孔性半透膜—超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术,与通常的分离方法相比,超滤不需要加热,不需添加化学试剂,操作条件温和,没有相态变化,具有破坏有效成分的可能性小、能量消耗少、工艺流程短等优点。
2.7 酶解提取法
酶解是一种能够最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一。中药的有效成分经常与蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等杂质混合,这些杂质不但影响植物细胞中活性成分的浸出,而且影响中药液体制剂的澄清度。选择恰当的酶,不但可以将这些杂质祛除,而且可以通过酶反应较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放提取,还可以促进脂溶性成分转化为易溶于水的成分而有利于提取。
2.8 高速逆流色谱技术
高速逆流色谱是一种固态支撑体或载体的液液分配技术是一种能
实现连续有效的分配功能的实用分离技术。近年来在天然药物研究
领域独显其特色和作用,它能构成连续、自动、高效和非高压的色
谱系统,既能实现从微克量级的分离到数克上百毫升量级的制备提纯,又能用于未经处理的大量粗制样品的中间级分离以及直接与间接的高纯度分离,可望解决“要用质量标准不一致的原料,生产出质量标准
一致的成药”这一难题。
2.9 破碎提取法
破碎提取法是通过使植物材料在适当溶剂中破碎而达到提取的目的。破碎提取法操作简单,提取时间短,避免了高温加热,但目前还只是局限于实验室研究,要应用于工业化大生产,仍需进一步研究。
2.10 液泛提取法
液泛法的应用原理是利用加热溶剂时所产生的蒸汽,增加液相的湍动程度,提高溶质的扩散速率。同时,不断加入的冷凝液,使溶质与溶剂间保持较高的浓度梯度,提高了相间传质推动力,使提取率得到了提高。液泛提取法目前在中药有效成分的提取中应用还很少,其应用范围有待于进一步研究、扩大。
2.11 空气爆破提取法
空气爆破法的应用原理是利用药材组织中的空气受压缩后突然减压时释放出的强大的力量冲破植物细胞壁,撕裂植物组织,使药材结构疏松,有利于溶剂渗入药材内部,以及溶剂在药材颗粒内部的运动和输送。空气爆破提取法适用于提取植物的根、茎、皮、叶等多纤维
药材,但不适用于短纤维和高含淀粉的药材。
固相微萃取(SPME) 是一项新型的无溶剂化样品前处理
技术。SPME 以带有特殊涂层石英纤维作为固相提取器将其
浸入样品溶液或顶空提取,然后直接进行GC ,HPLC 分析。
SPME由Pawliszyn[1 ]1989 年首次报道,近10 年来SPME 技术
已成功的应用于气体,液体及固体样品的前处理。至今在环
境分析领域已经较成熟,但在天然产物分析研究领域的应用
正处于起步阶段。
　2.12 固相微萃取技术及原理
固相微萃取法是以固相萃取为基础发展起来的方法,SPME利用了固相萃取吸附的几何微区效应,其装置结构的超微化决定了它能避开经典固相萃取的许多弱点。固相微萃取技术是在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(萃取头) ,再将萃取头直接浸入样品溶液(直接浸没2固相微萃取方法,简称DI2SPME) 或采用顶空-固相微萃取方法(HS2SPME) 采样。由于聚合物涂层的种类
很多,因而可对样品组分进行选择性富集和采集。固相微萃取的原理是一个基于待测物质在样品及萃取涂层中平衡

三：中药质量评价：中药指纹图谱与系统生物学在中药质量评价与控制中的应用
中药的质量控制和评价是中药现代化的关键问题之一，也是中药研究的难点和热点。中药质量控制的目的是保证中药的有效性和安全性。中药质量控制就是监测中药的药效物质、有毒物质及其变化规律，是依据一系列质量标准对中药生产过程中的每一个环节进行质量检测与控制。而中药质量评价的技术、方法和策略的研究是制订科学、合理、先进的质量标准的基础。一些研究者提出了建立基于道地药材和生物效价检测的中药生产质量管理模式的构想，即在严格控制的试验条件下，通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应，从而控制和评价中药的质量和活性。这种模式突出体现了中药的作用效应，而不只是某些成分，其应用正在摸索中。如果能够有简便易行的生物效应测定法，此种模式将有效控制中药的实际质量。中药发挥药效作用除了多成分的特点外，还以多靶点、多层次对机体产生作用。以代谢组学为核心的系统生物学开启了研究中药整体性复杂成分与机体这一复杂生物系统相互作用以及中药“内在”、“综
合”质量的控制和评价新模式的可能性。。可根据每味中药材都含有多种化学成分的特点拟以中药材所含组分的指纹图谱⋯(包括：高效液相色谱HPLC、高效毛细管电泳色谱HPCE等)进行其品种鉴定(真伪)；同时，根据中药材所含的化学成分特点，采用先进的分析技术(高效液相色谱、高效毛细管电泳色谱、分光光度法等分析方法)，对中药材中主要成分含量进行比较分析，并采用数据挖掘技术，以灰色关联度分析模型12’，进行中药材质量评价模式的研究；并采用多元相关分析与逐步回归分析等多元统计方法，优选、简化质量控制指标，从而建立中药材质量评价的技术平台，为中药材的标准化、国际化提供理论依据和实验基础
1、中药指纹图谱
中药指纹谱是指借助于现代仪器分析手段将中药化学成分组合物中的某类化学物质或各个化学物质的化学信息从定性和定量两个角度以图形(图像) 的方式来表征并加以描述的图谱。最常见的、用得最多的是色谱峰形式。在应用中,它借用了法医学的指纹鉴定的概念,具备个体的绝对唯一性、物种特征的唯一性和同种个体之间的相似性,否则,它就没有鉴别意义了。在现阶段的应用中,指纹谱获取和指纹谱计算是两个核心问题。指纹谱获取是指采用色谱、光谱或联用等仪器分析手段获取能表征中药化学成分组合物组成特征的组分群体分析图谱或图像;指纹谱计算是指运用计算分析技术对所获得的图谱或图
像数据进行科学处理,通过筛选、简并和综合,获得专属、宏观、整体的化学特征信息,并对组合物中化学组成的总体差异程度进行定量估测。处理方法可应用多元统计、人工神经元网络、统计学习、模式识别、模糊数学、最优化技术等。在综合处理和分析上,化学特征提取、化学模式分类、相似性测度性能评价、统计质量控制计算、相似度计
算和算法性能等都直接影响中药指纹谱的可靠性。国内不同的研究组开发了各具特色的功能软件,在使用和功能上各有千秋,应有相应的监管部门统一协调,各取所长,发展形成国家认证、认可的中药指纹谱计算分析方法学体系。
中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标志该中药特征的色谱图或光谱图。指纹图谱强调的是多个成分以相对稳定的比例关系及位置顺
序相互制约的完整的色谱或综合的光谱特征，即指纹图谱的整体性特征和共同特征的基础上个体之间又相互有差异的模糊特征性。这与中医药理论的机体整体调节和辨证施治的原则相一致。评价及与药效和毒性相关的评价中的作用。
中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式，由于国情和传统的原因，不同国家的应用方法和思路有某些差异。日本把采用道地药材按饮片配方煎煮得到的煎汁作为标准提取物， 标准提取物的指纹图谱即为标准指纹图谱， 以此对生产的原料、配方和工艺作严格控制， 使成品指纹图与标准指纹图谱一致。法国和德国的植物药制剂大多以“标准浸膏” 投料， 减少了以植物药为直接原料带来的不稳定性， 然后严格控制生产工艺的各个过程， 保证成药指纹图谱的稳定性。质量控制可以采用指纹图谱。在国外对植物制剂的指纹图谱研究中， 主要是针对单味药材提取物而言， 在植物制剂的整体性作用和药效相关性方面缺乏理论依据和相应的理论指导， 并不适用于中药材及中药制剂的质量评价。国内中药指纹图谱研究开始仅作为一种指纹性对比， 用于鉴定中药材的种属。如HPLC、GC、TLC、CE、IR 等以及一些联用技术。但是研究仍处于起始阶段， 对指图谱在质量控制方面的全面认识有待深化
（1） 中药指纹图谱分析方法
薄层色谱是最早用于中药指纹图谱研究的技术，也是目前用于中药真实性评价的普遍方法。HPLC及其各种联用技术几乎成为中药指纹图谱的通用工具。
a. 毛细管电泳分析
它是年来兴起的一种新型分离方法。它以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离。这一技术与高效液相色谱法相比,具有制样要求低、分离效率高、分析时间短、进样量少、检测限低、重现性好、柱子不易污染、仪器简单、自动化程度高等优点。
b.光谱法也是有效而简便的指纹图谱分析方法。
c. 薄层色谱法
薄层色谱法具有设备简单、操作方便、分离速度快等特点。
一般采用吸附薄层，吸附剂大多用硅胶和聚酰胺。常被作为定
性和半定量的手段
d. 各种色谱联用技术。在中药质量标准控制方面也有较好的前景。HPLC—MS,HPLC-NMR,HPLC--IR等方法
e. 气相色谱法GC
f. 高效液相色谱法HPLC
分析方法主要有比色法、分光光度法、极谱法、、模拟移动床色谱、超临界液体色谱。
（2）中药指纹图谱作用
．指纹图谱用于中药的质量一致性和稳定性评价
指纹图谱信息量大，特征性强，能较有效地表征中药产品质量，指纹图谱技术除用于中药材产地、采收季节、储存时间等因素的考察，为药材的质量控制提供依据外，更用于评价中药产品的质量一致性及
稳定性，用以中药生产过程的质量控制。通过对药材、中间体和成品制剂指纹图谱的相关性研究，利用指纹图谱作为监控手段控制投料药材和中间体的质量，以保证中药制剂的质量稳定性。我们在进行复方大青叶注射液指纹图谱研究时，为其组成药味的药材建立了标准指纹图谱；同时对生产工艺中每一步所得的中间体都进行指纹
．指纹图谱用于中药的真实性评价
通过比较，根据指纹图谱谱峰的强度和位置对各种成分进行分析对比，从而确定是否是同一种成分图谱分析，找出了影响产品质量的关键步骤；企业用；企业用指纹图谱监控生产过程，使各企业的产品的质量均一、稳定。许国旺课题组1211建立了参麦注射液的特征指纹图谱，适用于参麦注射液生产质量的控制。曹进等I恐1建立了复方清开灵注射液的指纹图谱，并同时对其中7种成分进行了定量测定，为其质量控制提供了一种可以同时实现整体定性、指标成分定量且简便易行的方法模式。
．中药指纹图谱用于中药的药效相关性评价
将中药指纹图谱所体现的化学成分信息与中药的体内外活性即药效信息相结合，是评价中药质量与药效相关性的又一进展。这种方法是利用计算机技术和化学统计方法将指纹峰及其面积等化学数据与中药的主要药效数据进行回归分析、主成分分析等相关处理，提取与药效相关的有效成分群，并以此为其质量控制的指标。这种方法尤其适合于中药复方制剂的研究。在《伤寒论》名方苓桂术甘汤的研究中，采用逐步回归分析和典型相关分析将指纹图谱和药理指标二类数据相关联，发现17个峰所代表的化学成分对药效有显著贡献，可作为其质量控制指数。这种与药效相关联的中药指纹图谱弥补了单纯
化学指纹图谱的不足，可为中药质量控制提供更为
科学有效的数据。
2、系统生物学
（1） 系统生物学
系统生物学作用系统生物是美国的Hood教授提出的概念和研究体系。它涵盖了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多种组学I雏刎。系统生物学是以整体性研究为特征的一门科学，其认识生物的观点是从局部观走向整体观，从线性思维走向复杂性思维。应用系统生物学的各种组学策略和技术对中药的种质资源、配伍规律、内在成分和药效物质、作用机制和作用靶点及安全性等进行研究，将为实现中药“内在”、“综合”质量的评价和控制奠定重要的基础。
(2)系统生物学的作用
1．系统生物学在中药种质资源和中药材质量控制中的作用
大部分中药都来源于植物，但随着野生植物资源短缺，相当一部分中药材由野生型改为人工繁育、种植，我国建立了数百个中药材规范化种植基地。为确保中药资源的质量，需要以基因组学等技术对中药种质资源进行研究。植物功能基因组学主要包括利用分子生物学和生物信息学方法系统地研究与其成分的生物合成及其代谢调控相关的基因；比较分析DNA指纹图谱，对相关基因进行功能分析，确定影响其品质的基因。中药材基因组学研究将能建立道地药材的真伪鉴别系统，以确保中药材的质量，保护名贵、稀有中药材的种质资源。例如，用DNA芯片可鉴别不同种属石斛[30l，marK基因的测序分析可成为杜仲正品鉴定的有效手段t311。此外，对药用植物野生株和人工繁育株的代谢表型、在不同外界环境影响下的活性化合物代谢途径和相关代谢网络进行代谢组学研究，也将有利于解决遗传育种和品质改良中的问题，为中药资源的可持续发展提供科学依据和保障。利用代谢组学方法检测代谢物的变化能够判断基因表达水平的变化，从
应用代谢组学技术监测药材的整体代谢物组是评价药材质量的一种综合模式。许国旺课题组采用气相色谱和气质联用技术对青蒿的植物代谢物及代谢指纹谱进行分析，发现青蒿在不同的生长阶段的代谢指纹谱有明显的差异。用代谢组学方法对中药银杏叶的次生代谢物的影响因素进行研究，发现光照使银杏苦内酯、白果内脂含量升高，甚至采摘时间也会对银杏叶的次生代谢物的含量产生影响[341。Tianniam等㈣采用GC—TOF方法分析了日本不同产地东当归的代谢物组，并结合主成分分析实现了对东当归栽培基地、气候和处理方法的有效区分。用1H—NMR获得的迷迭香全成分谱可实现对采收季节的检测区分闭。由此可见，基因学和代谢组学方法能实现中药道地性、品质及其影响因素的有效监控。治疗疾病。代谢组学通过认识机体“代谢指纹图谱”变化的原因，阐明中药作用的靶点或受体，在阐明作用机制的同时，搞清发挥作用的物质基础。在中药药效物质基础的代谢组学研究方面，罗国安等1371提出了“化学物质组学”的研究思路，并按照此思路进行了清开灵注射液的药效物质和配伍研究。将有效组分配伍，组成新复方，为组分中药作为复方药物提供了理论基础。我们应用代谢组学的策略进行中药的药效物质组学研究闭，对补肾中药淫羊藿、骨碎补等进行的系统研究中，获得其化学成分谱、进人体内的成分及其产生的代谢物谱；比较大鼠体内基础代谢物谱、肾阳虚大鼠代谢物谱及给药干
预后的代谢物谱，探索其补肾作用机制及药效物质组I剪删。刘昌孝课题组用代谢组学方法研究了钩藤等多味中药组成的多动合剂的药效作用物质基础，发现该中药激发机体形成洋地黄样的多肽物质是缓解心衰的物质基础。系统生物学中的代谢组学、蛋白质组学和基因组学都有报道用于中药作用机制研究
，2．2．系统生物学在中药药效控制和作用机制研究中的作用
中药进入机体后，以其多组分、多靶点协同作用而发挥药效作用，协调干预人体内源性代谢物组来代谢组学研究的报道更多。采用GC／MS和多元统计方法对氢化可的松诱导肾虚证及用温阳中药干预后大鼠的生物化学谱进行代谢组学研究，发现温阳中药对肾阳虚的作用机制1421。在对人参总皂苷双向调节高血压作用机制研究中，通过分析相关生物标志物的形成、转运机制和过程，深入了解高血压的发病机制和人参总皂苷的双向调节作用。对乙醇引起肝毒性的大鼠给予传统中药制剂——茵陈蒿汤，研究治疗组、肝中毒组和空白对照组大鼠尿液代谢组的差异，确定神经胺(d18：1／25：0)为乙醇所致肝毒性的标记物，茵陈蒿汤显示对不正常代谢途径的“修复”作用m1。依据多基因致病的关联特性，通过蛋白质表达谱和表达产物的差比性分析，可以揭示证候发生和发展的分子水平调控规律，进而可能揭示中药的作用靶点、作用环节和作用过程，也能发现有效成分及各成分间的协同、拮抗关系。例如，用二维凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分析肝郁证模型大鼠血清蛋白质组的差异表达，筛选出的差异表达蛋白质主要涉及免疫、神经内分泌和营养物质代谢，表明从蛋白质组学的角度研究”证”实质的可行性。沈自尹等用“病证结合”模型和系统生物学方法研究中药对机体的干预。如用中药淫羊藿总黄酮干预衰老大鼠，采用基因芯片技术研究下丘脑一垂体一肾上腺一胸腺(HPAT)轴的基因表达谱以及与药物干预的基因表达差异谱。结果提示淫羊藿总黄酮能上调神经递质受体的表达并通过NEI网络的下行通路激活神经内分泌和免疫系统，重塑淋巴细胞基因表达的平衡，延缓免疫衰老。由此可见，系统生物学从分子、基因、受体及代谢网络多角度来阐明中药整体调节作用，从深层次全面揭示中药药效物质，为创新中药质量控制和评价模式奠定科学基础。
3．系统生物在重要安全性评价和预测研究中的作用
中药毒性的产生和其药效的作用模式相似，因此用能够反映整体思想的系统生物学技术对中药的安全性进行评价更具有科学性。代谢组学已被广泛用于候选药物的毒性评价。Nicholson等基于核磁共振技术的代谢组学方法在化学药物的肾毒性和肝毒性评价和筛查等方面已取得显著成就。代谢组学能快速发现毒性物质和毒性机制，而且试验取样方便、无创，显然也十分适合中药安全性评价。马兜铃酸及相关中药的肾毒性是中药安全性研究的热点。以色谱一质谱联用技术对马兜铃酸及关木通对机体代谢物的整体影响进行代谢组学研究，建立了代谢组学评价中药肾毒性的方法[491。还有应用核磁共振技术进行中药关木通所致大鼠急性肾毒性的代谢组学研究，发现大鼠尿液的代谢改变及其与靶器官毒性的相关性例。对乌头饮片～黑顺片的毒性进行的代谢组学研究发现其对大鼠的心脏具有剂量依赖性毒性。由此可见，应用代谢组学策略对中药毒性进行科学的综合研究，对于确保中药的合理、安全用药，建立现代中药的安全性评价和预测体系，以及复方中药的配伍减毒机制的_研究都具有重要的