心型脂肪酸结合蛋白纯品含量的柱前衍生超高效液相色谱方法研究.pdf

书书书第 卷第 期 年月计 量学报 ，：心型脂肪酸结合蛋白纯品含量的柱前衍生超高效液相色谱方法研究崔宏恩，冯 速，叶人元，刘 阳，方 帅，朱茂林，樊晓琳（江苏省计量科学研究院，江苏 南京 ；南京诺唯赞生物科技股份有限公司，江苏 南京 ）摘要：心型脂肪酸结合蛋白（）被酸水解后，以氨基酸混合溶液国家标准物质为标准，氨基丁酸为内标，经柱前衍生剂处理，再采用超高效液相色谱法可测定其中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸 种衍生物的量，进而推算出 纯品的含量。将此方法的测定结果与同位素稀释质谱法测定 含量的结果相比较，可验证所建方法的准确性。实验显示，在最优条件下，所建立的柱前衍生超高效液相色谱（）法中 含量测定结果为 ，相对标准偏差为 ，扩展不确定度为 （），检出限和定量限分别为 和 。此外，该方法成本较低且溯源链清晰，可作为一种补充验证方法用于纯品 标准物质的定值。关键词：计量学；心型脂肪酸结合蛋白；定量分析；柱前衍生超高效液相色谱法；同位素稀释质谱法中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：（），（），（），：；收稿日期：；修回日期：基金项目：江苏省市场监督管理局科技计划（）引言脂肪酸结合蛋白（）是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子量 。目前已发现的 有 种类型，其中心型 （，）在肌红蛋白方面具有高度的特异性，红骨骼肌、主动脉壁的平滑肌细胞、内皮细胞、胃腺体的壁细胞和睾丸间质细胞中亦有，少量存在于肾脏、白骨骼肌、肾上腺、脑，但肝脏、脂肪组织内无 分布 。具有稳定的细胞内半衰期，约 。是世界卫生组织推荐的一种早期诊断心肌缺血的新型血浆标志物，是心肌细胞损伤的早期生物学指标，缺血性损伤后，心肌细胞内的 迅速释放到血液，监测其在血液中的浓度对心肌梗死、预防心力衰竭、心房颤动和室性心律失常等疾病的早期识别、危险分层及预后判断有很高的预测价值 ，。临床上，通常使用各种免疫法对 进行测定，常用的免疫分析试剂产品种类也很多，但不同厂家的不同产品所得结果存在较大偏差 。根据 ：要求 ，为了保证 测定结果的准确可比，必须建立可溯源的 纯品含量测定方法。目前，纯蛋白的定量方法主要有氨基酸分析、质量平衡、定量核磁和同位素稀释质谱法 ，。氨基酸分析涉及的多种分析方法在生物化学、蛋白质组学、临床医学、食品科学、化工等领域有着广泛的应用 。通过对基于柱前衍生的氨基酸分析方法进行优化和改进 ，以可溯源到 单位的氨基酸混合溶液国家标准物质为标准，可满足临床检验的需求。首先，采用 和质谱对 纯品进行纯度表征、分子量测定和蛋白质鉴定。然后对 酸水解、柱前衍生化和色谱条件等进行优化，建立起 纯品蛋白含量的柱前衍生超高效液相色谱（）测定方法。最后，以高效液相色谱 同位素稀释质谱（）方法测定结果作为参照进行对比，考察所建立柱前衍生 方法的方法学参数。本研究基于以上内容以验证柱前衍生 法作为一种补充方法用于纯品 标准物质定值的可行性。仪器与试剂 仪器超高效液相色谱仪（，美国 公司），配自动进样器和紫外检测器；超高效液相色谱仪（，美国 公司）；质谱仪（，美国 公司）；电泳仪（美国 公司）；常温高速离心机（，美国 公司）；计（，美国 公司）。试剂氨基酸混合溶液标准物质（），中国计量科学研究院）；氨基喹啉基 琥珀酰 亚胺基甲酸酯（）衍生剂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氟乙酸（美国 公司）；甲酸（德国 公司）；乙腈（美国 公司）；蛋白质电泳预制胶（，常州天地人和生物科技有限公司）；缓冲溶液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；彩虹预染宽分子量蛋白 （，）；胰蛋白酶（美国 公司）；二硫苏糖醇（，美国 公司）；碘乙酰胺（瑞典 公司）；碳酸氢铵（，美国 公司）；天冬酰胺粉末、谷氨酰胺粉末、色氨酸粉末、半胱氨酸粉末（美国 公司）；无水乙酸钠（美国 公司）；三乙胺（南京化学工业公司）；乙二胺四乙酸二钠（美国 公司）；硼酸（美国 公司）；三氯乙酸（北京国药集团化学试剂有限公司）；氨基丁酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。基本性质表征 纯度测定将 样品与 （含 巯基乙醇）在一个 离心管中混合（样品与 体积比为 ），盖紧；沸水中放置 ，完全冷却后瞬时离心 ；再使用移液器加入 分子量蛋白 。将电压调至 ，待样品中溴酚蓝指示带电泳至分离胶位置（约 ）；再以 电压将溴酚蓝指示带电泳至距玻板最下方约 处，停止电泳，时间约 。分析结束后用考马斯亮蓝染色 时，加脱色液（水、甲醇和冰醋酸以 的比例配制）过夜脱色。相对分子量测定和蛋白质鉴定 样本前处理取离心后的 上清样品加入到 超滤离心管中，离心 ；而后加入 常温反应 ；加入 至终浓度为 ，避光反应 后再次 离心 ；加入 的 碳酸氢铵后 离心 ；更换新的套管，滤膜上加入含有 胰酶的 的 碳酸氢铵，酶解 。过夜酶解的肽段离心加酸终止酶解，用 柱除盐后真空冷冻干燥。液相色谱 质谱联用分析取肽段粉末，用 （文中均为体积比）甲酸计量学报 年 月复溶后于超高效液相仪中进行洗脱分析。流动相 为 甲酸水溶液；流动相 为含 甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度：（），；（），；（），；（），；（），；，；流速为 。肽段经洗脱电离后串联至质谱仪进行分析。离子源电压设置为 ，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨质谱仪进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为 ，扫描分辨率为 ；二级扫描分辨率为 。数据采集模式使用数据依赖型扫描 ，碰撞池使用 的碎裂能量进行碎裂，串联质谱扫描的动态排除时间设置为 ，分子量平行测定 次。柱前衍生 测定 蛋白含量 样品的水解向待测 样品加入 的盐酸，使用氮吹仪排尽空气后密封，在（）的烘箱中进行水解，取出平衡至室温后通过氮气吹干其中的盐酸，然后加入 的盐酸复溶 。配制内标工作液首先，称取 三氯乙酸，溶解于 超纯水中形成 三氯乙酸溶液。然后，称取 氨基丁酸，使用 三氯乙酸溶液溶解成 氨基丁酸溶液，即内标工作液。配制混合标准工作液分别使用 盐酸将天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、半胱氨酸配制成 单标储备液（配制单标储备液，是为了便于观察其他氨基酸是否会干扰 种氨基酸）置于 保存，有效期 个月。然后，称量 种氨基酸混合溶液国家标准物质及配置的 种单标储备液，用超纯水稀释成 的 种混标氨基酸标准工作液 置于 保存，有效期 周。将 种混标氨基酸标准工作液稀释成氨基酸浓度分别为 、和 的混合标准工作液。水解样品的衍生化分别吸取各待测 水解样品、混合标准工作液 至 离心管中。随后，吸取内标工作液 至以上各离心管中。再次，将各离心管于 转速离心 。最后，以 作为柱前衍生剂，吸取各离心管离心后的上清液 、硼酸缓冲液、衍生溶液，于 水浴 。溶液过 滤膜后入进样小瓶待测。分析经优化，确定如下色谱条件：色谱柱 ，流动相 为 三乙胺（）乙酸钠 乙二胺四乙酸二钠溶液；流动相 为乙腈，柱温为 ，进样体积为 ，检测波长为 ，流速为 。流动相梯度洗脱表如表 所示。采用 依次对配制的混合标准工作液和 样品溶液进行检测，记录 信号强度，利用混标氨基酸标准工作液建立氨基酸浓度 峰面积标准曲线，计算 样品中各氨基酸浓度。表 流动相梯度洗脱表 （）时间 结果计算根据下式计算待测蛋白的质量浓度：式中：为待测蛋白样品的质量浓度，；为待测蛋白样品中所选择氨基酸的物质的量浓度，；为待测蛋白样品的相对分子质量；为待测样品每个分子中所选择氨基酸的个数。所选择氨基酸为天冬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸中的任一种或任几种。所选择氨基酸为任几种时，待测样品中蛋白的质量浓度为每种氨基酸计算出的待测样品中蛋白的质量浓度的平均值。计算时选择的氨基酸种类越多，计算蛋白含量的平均值误差就越小，实际可以根据情况进一步选择 种氨基酸中分离洗脱情况比较好的氨基酸种类进行计算。结果与讨论 基本性质的表征 纯度测定结果纯品 的 电泳纯度测定结果见图 ，条带位于 附近，与构建的第 卷第 期崔宏恩等：心型脂肪酸结合蛋白纯品含量的柱前衍生超高效液相色谱方法研究蛋白分子量理论值 和与文献 和 报道均一致。图 纯品 的 电泳纯度测定结果 相对分子量测定和蛋白质鉴定结果纯品 的相对分子量测定结果见图（），次重复测定结果的平均值为 ，为 ，分子量测定结果与构建的蛋白分子量理论值 、测定结果和与文献 和 报道均一致。纯品 酶切后的质谱图见图 （），图中可见酶切出的肽段，经蛋白质鉴定后，可确认肽段来自于 ，得分为 。柱前衍生 法评价首先，对柱前衍生 法测定纯品 结果的不确定度进行评定 ，。实验采用了天冬氨酸（）、谷氨酸（）、组氨酸（）和精氨酸（）对蛋白质含量分别进行测定，并取其平均值，各氨基酸浓度的计算式表示为：（）式中：为待测蛋白样品中所选择氨基酸的物质的量浓度，；为待测蛋白样品中所选择氨基酸的色谱峰面积，；为标准工作液中所选择氨基酸的物质的量浓度，；为标准工作液中所选择氨基酸的色谱峰面积，。因此应分别计算各个氨基酸对蛋白质定量结果的不确定度，以 为例，测量不确定度的主要来源为称量、定容、色谱峰面积、水解效率、方法重复性和氨基酸混合溶液标准物质。根据天平的检图 纯品 的相对分子量测定和酶切鉴定结果 定证 书 及 确 定 称 量 的 不 确 定度 ，称量 三氯乙酸、氨基丁酸称量、氨基酸混合溶液标准物质（）及配置的 种单标储备液（）时的最大允许误差均为 ，按照均匀分布，计算得到称量引入的相对不确定度分量为（）（槡 ）（）（槡 ）（）（槡 ）（）（槡 ）（）配制内标工作液和混合标准工作液定容过程中，使用 单标线 级容量瓶 次，单标线 级容量瓶 次，根据 常用玻璃量器检定规程 ，单标线 级容量瓶的最大允许误差为 ，单标线 级容量瓶的最大允许误差为 ，按照三角分布；实验室温度为（），水的体积膨胀系数为 ，按照均匀分布，则由定容引入的相对不确定度分量为（）（槡 ）（）（槡 ）（）（槡）槡 （）计量学报 年 月根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前用于仪器色谱峰面积积分处理的最大误差为 ，取 ，按照均匀分布，则色谱峰面积引入的相对不确定度分量 槡 槡 （）按照不确定度 类评定方法评价该方法重复性引入的不确定度分量，次重复测定结果的 为 ，因此，测定结果平均值的重复性相对不确定度分量 为 槡 （）根据 （）氨基酸混合溶液国家标准物质证书，其中 的标准值为 ，（），所以由 标准物质引入的相对不确定度分量为 （）水解效率引入的相对标准不确定度 均按照 估算，则采用 测定蛋白质含量结果的标准合成相对不确定度为，槡 （）同样地，采用 、和 测定蛋白质含量结果的标准合成相对不确定度分别为：，；，；，。取 ，最后结果的扩展不确定度为 ，槡 方法的扩展不确定度为 采用优化建立的柱前衍生 方法测定同一 样品，重复测定 次，所得结果的平均值为 ，为 ，可见所建方法重复性良好。采用优化建立的柱前衍生 方法测定个 样品，每个样品重复测定 次，所得结果的平均值为 ，为 ，可见所建方法再现性良好。与纯品 含量 测定结果的对比分析取 个纯品 样品，对每个样品重复测定 次，实验采用了 、和 对蛋白质含量分别进行测定，并取其平均值。经计算，测定的纯品 含量为 ，为 。同时，参照柱前衍生 法不确定度评定思路（不确定度的主要来源为称量、水解效率、方法重复性和氨基酸标准物质）计算的 方法的扩展不确定度为 （）。与 测定结果相比纯品 的柱前衍生 法测定结果具有 的相对偏差，同时经过计算柱前衍生 法与 法之间的 值为 ，说明柱前衍生 法对纯品 的测定结果相对准确可靠。柱前衍生 方法的检出限与定量限评价柱前衍生 方法的检出限和定量限为 式中：为检出限，；为定量限，；为标准曲线最小浓度样品中所选择氨基酸的物质的量浓度，；为待测蛋白样品的相对分子质量；为待测样品每个分子中所选择氨基酸的个数；为噪音；为检测器灵敏度。经过计算，的检出限与定量限分别为 和 。因此，只要柱前衍生 方法对纯品 的测定结果大于检出限与定量限，其结果就是相对可靠的。总结本文建立了纯品 含量的柱前衍生 测定方法，经过方法学参数考察和与 测定结果的比较表明，所建立的柱前衍生 方法溯源清晰、准确度高，相比 方法成本更低，便于推广应用，或可作为一种补充验证方法用于纯品 标准物质的定值。在建立我国 测定结果的量值溯源传递体系、保证相关试剂盒生产和临床诊断中 测定结果的准确可比方面具有一定的应用价值。参考文献 ：，（）：王羊洋，高大胜 心脏型脂肪酸结合蛋白在急性心肌梗死诊断中的应用进展 安徽医药，（）：，第 卷第 期崔宏恩等：心型脂肪酸结合蛋白纯品含量的柱前衍生超高效液相色谱方法研究 ，（）：项欣，杨丽，郭宇璇，等 心型脂肪酸结合蛋白在急性心肌梗死中的诊断准确度的 分析 新疆医学，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：赵艳丽，李为民 心脏型脂肪酸结合蛋白与心血管疾病关系的研究进展 心血管病学进展，（）：，（）：，（）：宋德伟，董晓杰，徐蓓，等 反应蛋白纯品的同位素稀释质谱法测定与国际比对 质谱学报，（）：，（）：，李佳乐，武利庆，金有训，等 人血清白蛋白纯品含量的同位素稀释质谱方法研究 计量学报，（）：，（）：李佳乐，武利庆，刘文丽，等 人转铁蛋白含量同位素稀释质谱测定方法研究 中国测试，（）：，（）：丁松，黄和，胡邁 氨基酸分析研究进展 生物加工过程，（）：，（）：何继杰，张晓凤，钱莉莉，等 痕量氨基酸分析方法研究 进 展 分 析 科 学 学 报，（）：，（）：王萍亚，周勇，黄鹂，等 柱前衍生化高效液相色谱荧光检测法测定水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留 计量学报，（）：，（）：江苏省计量科学研究院（江苏省能源计量数据中心），南京诺唯赞生物科技股份有限公司 基于柱前衍生 超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法：电子天平检定规程 常用玻璃量器检定规程 李兰，贾铮，周剑，等 高效液相色谱法测定鱼粉中色氨酸及不确定度评定 食品安全质量检测学报，（）：，（）：第一作者：崔宏恩（），男，安徽亳州人，江苏省计量科学研究院高级工程师，主要从事生物计量和标准物质等方面的研究。：计量学报 年 月