植物生理学综合实验.ppt

Haga clic para cambiar el estilo de ttulo,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,植物生理综合实验,细胞死活与H2O2鉴定,学号 姓名,1,一 实验目的：,1.,了解信号物质、激素对植物子叶的影响,2.掌握细胞死活与过氧化氢鉴定方法,二,实验原理：,植物受到一些物质处理时，会作出相应的反应,。,产生活性物质（信号物质）。一些细胞甚至会死亡。这些反应可被检测。,2,三,实验内容：,一、茉莉酸甲酯对黄瓜子叶的作用,二、一些物质对茉莉酸甲酯作用的影响,1.,SNP/Hb,2.,乙烯利/CoCl,2,3.,H,2,O,2,供体/H,2,O,2,清除剂,SNP（硝普钠）是NO的供体，而NO是重要的植物信号物质。,ETH（乙烯利）是乙烯供体，乙烯是一种植物生长激素。,H,2,O,2,是信号物质，也是强氧化物。可以被检测。,3,观察和测定指标,1.观察茉莉酸甲酯处理黄瓜子叶的影响,2.细胞死活鉴定（Trypan blue）,3.活性氧的检测（DAB、NBT活性检测）,Trypan blue：台盼蓝,DAB ：二氨基联苯胺,NBT：氮蓝四唑,4,1.细胞死活的鉴定（Trypan blue）,原理：台盼蓝不能穿过活细胞质膜，只有死细胞染成蓝色，活细胞不能被染色。,过程：取10片子叶到烧杯中，加入适量的台盼蓝染液，抽真空5min，使得染液渗透进入细胞；水浴煮沸2min，然后用2.5g/ml的水合氯醛（95酒精）脱色至组织透明，观察和拍照，死亡细胞被染成蓝色。透明后的叶片也可以保存在50的甘油中，以备显微观察。,5,2.过氧化氢活体组织的定位（DAB）,原理：H,2,O,2,在过氧化酶的催化下可与DAB迅速反应生成棕色化合物，从而定位组织中的H,2,O,2,。植物叶片渗透（DAB）以定位H,2,O,2,是一种应用比较普遍的组织染色方法。,取处理后的黄瓜子叶浸入1mg/mlDAB的磷酸缓冲液（0.02mol/L，pH7.0）中，抽真空5min，然后于黑暗中放置8h。将叶片置于饱和水氨醛（95酒精）中脱去叶绿素，观察和拍照。透明后的叶片也可以保存在,在50的甘油中，以备显微观察。,6,3.氮蓝四唑 （NBT）进行O-组织化学定位,原理：NBT在O-的作用下还原成不溶于水的蓝色二甲替，此法测定灵敏度高，常用于O-的组织化学定位。,取子叶放入含有0.1NBT的10mM磷酸缓冲液中（0.02mol/L，pH7.0）中，真空渗透5min，然后将叶片置于饱和水氨醛（95酒精）中，水浴煮沸2min进行固定和脱色，待叶绿素完全褪去后进行观察和拍照。透明后的叶片也可以保存在在50的甘油中，以备显微观察。,7,种子萌发,所用的黄瓜品种为粤秀3号，采用滤纸培养法萌发种子。将种子均匀地拜访在铺有2层滤纸的保鲜盒中，加适量的水，以倾斜保鲜盒时在角底处约有1ml水为准，置28光照培养箱培养5-7d,子叶处理,摘取子叶整齐地摆放在铺有2层滤纸的培养皿中（9cm，取10对子叶），叶面朝上，叶背面贴靠滤纸，加入不同溶液进行处理（溶液不能太多，倾斜培养皿时，只能有约1ml液体）。置光照培养箱中培养（28，光照12h），培养1d、3d、5d取出培养皿观察和拍照，然后放回培养箱继续培养，培养7d观察和拍照后进行下一步实验。,8,四实验结果分析,4.1 各小组的实验结果,第一组,蒸馏水,茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),9,蒸馏水,茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),10,蒸馏水,茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),11,蒸馏水,茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),12,蒸馏水,茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),13,茉莉酸甲酯,（5104 mol/L),蒸馏水,14,茉莉酸甲酯,（5105mol/L),茉莉酸甲酯,（5106mol/L),15,第二组,浓度为100umol/LSNP对黄瓜子叶的影响,16,200umol/L SNP处理下的黄瓜子叶,17,300umol/LSNP处理下的黄瓜子叶,18,SNP处理子叶染色后结果展示,19,第三组,25umol/LHb处理下的黄瓜子叶,20,50umol/LHb处理下的黄瓜子叶,21,100umol/LHb处理下的黄瓜子叶,22,Hb处理的黄瓜子叶经染色后的变化,23,第四组（过氧化氢）,0.6%H2O2,0.,8,%H2O2,1.2,%H2O2,10月23日,24,0.6%H2O2,0.9%H2O2 10,月,24,日,1.2%H2O2,25,0.6%H2O2,0.9%H2O2 10,月,26,日,1.2%H2O2,26,0.6%H2O2,0.9%H2O2 11,月,12,日,1.2%H2O2,27,第四小组,DAB染色,台盼蓝染色,NBT染色,H,2,O,2,处理,从左到右的顺序 浓度分别为,0.6%、0.8%、1.2%,28,0.6g/LVc,处理下的黄瓜子叶,第五组,Vc,29,0.8g/LVc,处理下的黄瓜子叶,30,1.0g/LVc,处理下的黄瓜子叶,31,32,第六组,ETH,33,34,35,36,37,38,39,第六小组,ETH处理,40,25umol/L COCl,2,处理下的黄瓜子叶,第七组,41,50umol/L COCl,2,处理下的黄瓜子叶,42,75umol/L COCl,2,处理下的黄瓜子叶,43,第七小组,44,510-4mol/L MJ+300umol/L SNP,第八组,45,510-6 mol/L MJ+100umol/LHb,46,510-6mol/L MJ+1.0g/L ETH,47,510-4 mol/L MJ+75umol/L COCl,2,48,第八小组,49,50,510-4mol/L MJ+1.0g/L Vc,第九组,51,510-5mol/L MJ+1.0g/L Vc,52,510-5mol/L MJ+1.2g/L H,2,O,2,53,510-6mol/L MJ+1.2g/L H,2,O,2,54,55,4.2,实验结果分析,第一组 茉莉酸甲酯,由第一组的实验现象可以看出，随着茉莉酸甲酯的浓度的增高，植物衰老的现象越来越明显，而且做细胞活性实验后，也是随着茉莉酸甲酯的浓度越高，叶片也从透明到逐渐染成深色，这是因为随着茉莉酸甲酯的浓度越高，导致子叶片的死细胞也会越来越多，所以叶片的染色也是越来越深。,茉莉酸甲酯在植物生长和发育过程中是体现出类似激素的作用，能够促进种子的萌发，植物的生长、开花、还能促进叶片的衰老，块茎形成，果实成熟等。从第一组的实验可以看出茉莉酸甲酯促进了叶片的衰老，并且浓度越高，对细胞的衰老作用就越强。,56,第二组 硝普钠,SNP,从第二组的实验现象可以看出，随着硝普钠的浓度越来越高，子叶的衰老现象就越来越不明显，叶片的死细胞也越来越少，染色现象也越来越浅。,这是由于，硝普钠,SNP,是,NO,的供体，随着硝普钠,SNP,的浓度越高，那么培养基中的,NO,的浓度就越高。,NO,是具有生物活性和信号转导作用的易扩散分子，是植物细胞生长发育以及生理活动的调节因子。它不仅对植物的许多生命活动如种子萌发、叶片扩展、根系生长、逆境生理以及细胞的程序性死亡等具有直接的生理调节功能，而且作为防御反应中的关键信使。,NO,对植物凋亡有调控作用，对植物叶片的衰老的诱导作用与乙烯相似。可以通过调控,NO,的浓度水平来调节细胞凋亡的进程。,NO,对子叶的影响就是延缓子叶的衰老。,57,第三组 牛血红蛋白,Hb,牛血红蛋白，,NO,是具有生物活性和信号转导作用的易扩散分子，是植物细胞生长发育以及生理活动的调节因子。它不仅对植物的许多生命活动如种子萌发、叶片扩展、根系生长、逆境生理以及细胞的程序性死亡等具有直接的生理调节功能，而且作为防御反应中的关键信使。,NO,对植物凋亡有调控作用，对植物叶片的衰老的诱导作用与乙烯相似。可以通过调控,NO,的浓度水平来调节细胞凋亡的进程。本实验通过添加牛血红蛋白，作为,NO,的清除剂，具有降低植物细胞内,NO,浓度而起到对细胞生长衰老的调节作用。,58,第四组,H2O2,过氧化氢,从实验结果可以看出，过氧化氢的浓度越高，那么叶片的衰老速度也就越快，在测细胞的活性时，所对应的叶片的染色就越深，说明，高浓度的过氧化氢是促进叶肉细胞衰老的，导致在高浓度的情况下叶片的死亡细胞就越多。,H2O2,是信号物质，也是强氧化物。过氧化氢对植物叶片的生长具有促进衰老的作用。,H2O2,可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜脂质过氧化损伤，从而加速细胞的衰老和解体，是信号物质，也是强氧化物。,59,第五组,Vc,从第五组的实验现象来看，叶片并没有因为维生素,C,的在培养基中的含量增多而促进叶肉细胞的衰老，反而是因为维生素,C,含量的增多延缓了叶片的衰老。,那是由于维生素,C,是过氧化酶的清除剂，,H2O2,可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜脂质过氧化损伤，从而加速细胞的衰老和解体，是信号物质，也是强氧化物。而当加入维生素,C,时，则就抑制了过氧化物的作用，从而，抑制植物叶片的衰老。,60,第六组,ETH,ETH,是乙烯利，是乙烯的供体，它既能促进营养器官的生长，又能影响开花结果，并且在植物抗逆中发挥作用。,乙烯是一种气体，是能够促进衰老的植物激素。这样是符合我们的实验结果的，随着,ETH,的浓度升高，在培养皿中释放的乙烯浓度也越来越高，叶片的衰老现象也越来越明显，相对应的叶片的染色也越来越深。,61,第七组,CoCL2,CoCL2,对叶片对起延缓衰老的作用。适宜范围浓度的钴对植物种子萌发，幼苗生长具有一定的促进作用，钴有可能通过调节活性酶和乙烯的代谢而发挥其生理作用。钴是乙烯合成的一种重要的抑制剂，通过抑制该酶的活性显著抑制乙烯的产生。所以,CoCL2,对叶片的生长具有延缓衰老的作用。,62,第八组,MJ,与,NO,、,H2O2,的关系,由于茉莉酸甲酯对叶片是起到一个促进衰老的作用，而,NO,是起一个延缓叶片衰老的作用，所以第八组的第一个实验现象可以看出，两种试剂的作用是相互抵消了的，第二个试验中的牛血红蛋白是减缓叶片衰老的，所以当他和茉莉酸甲酯一起使用是，也是呈一个作用相互抵消的效果的。,第八组的第三个实验是用茉莉酸甲酯和乙烯利一起运用，由于茉莉酸甲酯和乙烯都是促进叶片衰老的，所以，此时，两者的作用相互叠加了，第四个实验是将茉莉酸甲酯和氯化钴一起合用，氯化钴是起减缓衰老的作用的，所以两者的作用相互抵消了。,63,第九组,MJ,与,NO,、,H2O2,的关系,第九组组要是两个实验，第一个是将茉莉酸甲酯和维生素,C,合用，维生素,C,是延缓叶片衰老的，茉莉酸甲酯的促进叶片衰老的，两者的作用应该是相互抵消的。第二个是将茉莉酸甲酯和过氧化氢在一起合用，两者都是促进细胞衰老的，当一定合用是，衰老效果更加的明显，因为两者的作用相互叠加了。但是第一个实验的实验现象在鉴定细胞活性的时候，结果却不是很明显，看了一下，叶片时没什么问题的，导致这样的原因可能是染色环节上出错了，有可能是脱色时间不够，也有也能是有光亮环境的时间过多，导致脱色效果不好等等。,64,