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靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR

20世纪80年代初，科学家用显微注射的方法将外源DNA片段导入小鼠受精卵的原核中，构建出了世界上第一个转基因小鼠，然而该方法只能将外源DNA片段导入动物基因组中，无法对体内基因组的特定序列进行特定的修饰。80年代后期，基于小鼠胚胎干细胞(ES细胞)及同源重组技术的发展而催生的基因打靶技术使得科学家可以对小鼠的任何基因序列进行随意的修饰。基因打靶技术的发展使生命科学的研究发生了革命性的改变，但用此技术制备基因工程动物模型过程较长和花费较大，且由于基因的修饰是在ES细胞中进行，目前的基因打靶技术还只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。

前些年，科学家发现，两种人工改造过的核酸酶，锌指核酸酶(Zinc-finger Nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后，细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。ZFN和TALEN技术结合了原核注射的制备周期短和基因打靶技术的定点修饰的特点，可以应用到除小鼠和大鼠之外的其他生物。但其脱靶效应(off target)，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
近年来，一种新型基因组修饰的技术——规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)受到人们的高度重视。CRISPR是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割和修饰。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作、效率更高和更易得到纯合子突变体，且可在不同的位点同时引入多个突变。
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，目前仍将是模式动物的构建的主要技术。但核酸酶ZFN/TALEN，尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应，将会被广泛应用于小鼠、大鼠及其他模式生物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。在此，对目前最受研究者青睐的两种靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR作一介绍，尤其是CRISPRR/Cas9技术，以供研究者在研究中加以选择和运用。

一、TALENT靶向基因修饰技术

TALEN [Transcription Activator-Like (TAL) Effector Nucleases]靶向基因修饰/敲除技术是前些年发展起来的一项极具革命性的新技术。TALEN蛋白分子包含DNA结合域和Fok1核酸酶，两个TALEN分子分别结合到靶点两侧，Fok1形成二聚体并发挥切割作用，生成双链断端，细胞内的非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)修复机制启动，断口被修复同时随机的删除和插入一定数量的碱基，造成移码导致基因失活。用TALEN方法制作knock out小鼠，不需要经过传统敲除所需要的ES细胞打靶阶段，周期大大缩短。相比于ZFN技术，TALEN的优势也非常明显突出，它的识别切割效率更高，几乎可以靶向任何序列，不受上下游序列的影响。此技术为研究者提供了一种新的思路，开辟了一条崭新的道路。
1 技术来源
TAL (transcription activator-like) effectors是细菌Xanthomonas感染植物时分泌的蛋白分子，这些蛋白分子通过其中心区的34个氨基酸的重复序列识别并结合到宿主基因的启动子上，激活植物基因的表达，从而帮助细菌进行感染。科研人员发现来自植物病原菌Xanthomonas中的TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。利用此恒定对应关系，构建与核酸内切酶的融合蛋白，在特异位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作，此

图1 Genomic control enabled by engineered TAL effector proteins [Science, Vol. 333, No. 6051. (30 September 2011), pp. 1843-1846]
特征很快被大家认识并利用来作为靶向基因编辑的工具，比如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或者基因修饰等(图1)。
2 技术原理(图2和图3)
  33-35个氨基酸重复序列构成了TALE的核心区域，可以特异性地识别DNA序列。为识别某一特定DNA序列，只需设计相应TALE单元串联克隆即可。然后，将识别特异靶DNA序列的TALE与核酸内切酶FokI偶联，构建成TALEN质粒。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白即特异性地与靶DNA结合。而两个TALEN融合蛋白中的FokI核酸内切酶形成二聚体，发挥剪切活性，在两个靶位点之间打断目标基因，形成DSB(Double-Strand Breaks)，诱发DNA损伤修复机制。细胞可通过非同源重组NHEJ (Nonhomologous End Joining)方式修复DNA，由于缺乏修复模板，在此过程中或多或少地会删除或插入一定数目的碱基，造成移码，使得目的基因失活或敲除，最终形成目标基因敲除突变体。产生DSB后，如果有同源修复模板，细胞可通过同源重组HR (Homologous Recombination)方式修复DNA，如果在细胞中转入的质粒含有修复模板，就可以对目标DNA做修饰，如点突变、碱基替换、碱基磷酸化、加入标记(如GFP、6XHis…)等等。

图2 TALEN原理(Nucleic Acids Research, 2011, 1–11)

图3 TALEN操作步骤
3 技术优势
该技术与同源重组相比，具有制作周期短，不需要经过ES细胞阶段，直接注射受精卵得到首建鼠，背景选择灵活和余地大，但对基因的改动小，通常只能造成几个到几十个bp的删除或插入，对基因的敲除是通过移码来实现的，可在现有小鼠模型上直接进行基因打靶。
与常规锌指核酸酶(ZFN)相比，TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系，能识别任意目标基因序列，不受上下游序列影响等问题，活性与ZFN相等或更好。因此，具有无基因序列、细胞和物种限制，实验设计简单准确和周期短、成本和毒性低，脱靶情况少，成功率几乎100%。
4 技术应用
目前TALENT技术主要有两种应用：1) 构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZEN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。2) 针对基因启动子上游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cDNA。TALE 技术现已经成功应用于细胞、斑马鱼、果蝇、大鼠、小鼠及植物上，并且被研究者不断地尝试应用到其他更多的物种(Tesson L，Nat Biotechnol 2011；Lei Y，Proc Natl Acad Sci USA 2012；Carlson DF, Proc Natl Acad Sci USA 2012)。
二、CRISPR/Cas9基因敲除技术

1987年，日本大阪大学(Osaka University)的科研人员在对一种细菌编码的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。不过这在当时并没有引起太多人的注意，报道只不过是一篇普普通通的小文章。关于这样一个重复序列他们当时在论文中是这样评价的——“我们目前也不太清楚这些序列的生物学意义。”不过这个在差不多三十年之前取得的不起眼的“小发现”现在却绽放出了耀眼的光芒，因为如今科学家正是利用这个小片段找到了一种可对多种生物的基因组进行遗传改造的工具，而且这种方法操作起来非常地简单，即现在被称为简便而又实用的基因组改造新技术——CRISPR/Cas基因敲除技术
1 技术来源
规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一类独特的DNA直接重复序列家族，它的结构非常稳定，长度约25～50bp的重复序列(repeats)被单一序列(spacers)间隔。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，广泛存在于众多原核生物基因中，其中II型为CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。自2002年首次被人们所定义以来，CRISPR一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/

图4 CRISPR/Cas系统
crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA，其中Cas9的HNH核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC-like结构域剪切非互补链。具体图4所示。
2 CRISPR的基本结构
随着细菌基因组学的发展，CRISPR的基本结构已逐渐被确定，由短的高度保守的repeat与长度相似的非重复的spacers序列间隔排列所组成(图4-A)。Repeats是一组高度保守的短小序列，其长度一般为25至50个碱基对。Spacers与repeats的长度相近，约为26到72个碱基对。此外一组约由4～10个保守基因组成的序列被发现于CRISPRs周围，我们称之为CASs(CRISPR-associated sequences，CASs)。在CAS蛋白中已鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-结合等结构域，因此，认为CAS蛋白参与CRISPR的转录、加工和外来基因序列的降解等过程。

图4 CRISPR的结构和操作步骤

3 CRISPR的分布和多样性
在已测序的约40%细菌和90%古细菌基因组中至少存在1个CRISPR座位(locus)，每个CRISPR座位具有几个到几百个R-S重复单位(图4-A)。根据CAS蛋白的序列同源性、组成情况和功能，可将CRISPR系统分为8个亚型：Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube，各亚型通常具有2-6个亚型特异的cas基因，在没有CRISPR系统的基因组中则不存在相关基因。cas1-cas6这6个家族广泛存在于不同的CRISPR亚型，被认为是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亚型，因此，cas1和cas2家族基因也被用作鉴定CRISPR系统的分子标记。此外，间区序列(S)也具有极其丰富的多样性。
3 技术原理(图5)
Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达这种蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或者质粒等外源DNA的侵入。利用Cas9内切酶家族来靶标和剪切外源DNA的II型CRISPR/Cas免疫系统来进行有效的靶向酶切。Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，这是因为这些向导RNA分子含有与靶DNA序列互补的序列，称之为PAM序列。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段“新的”遗传信息。

图5 RNA介导的Cas9系统定向基因组修饰作用机制

4 技术优势
与其它基因组工程技术比较，CRISPR/Cas9技术拥有以下技术优势(表1)：(1) 无物种限制，靶向精确性更高，可实现对靶基因多个位点同时敲除；(2) 使用更方便，费用更低，无论是ZFN 还是TALEN都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列，这些识别序列的合成或组装耗时耗力且费用很高，但Cas蛋白不具特异性，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰。(3) CRISPR/Cas系统只需改变很短的RNA序列(不超过100bp)就可实现不同位点的特异性识别，可避免超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。

表1 TALEN和CRISPR的比较
项 目
TALEN
CRISPR
制 备
最快的时间周期需要4天合成1对分子
CRISPR需要合成DNA Oligo，多2天，不过只需要构建1个克隆即可。对于新手而言，CRISPR更有吸引力
应 用
需要转染两个质粒进入1个细胞
需要转染两个质粒进入1个细胞。若要敲除2个位点，CRISPR只需再多转染1个质粒，在多位点敲除上CRIPSR更有潜力。若能将Cas9等蛋白预先转染进入细胞制备稳定株，后续只需要转染一个RNA片段即可，CRISPR具有高通量潜力。
转 染
TALEN的个头接近3 Kbp，常用慢病毒转导，但易出现重组。若用逆转录病毒和腺相关病毒转导很难。
CRISPR系统的信号序列相当于shRNA，慢病毒，逆转录病毒和腺相关病毒都可以用于转导
切割效率
TALEN对DNA的识别会受甲基化的影响
CRISPR中RNA对DNA的识别不受此限制，效率比TALEN好
特异性数据
TALEN的识别包括30-40个碱基，特异性不错
CRISPR只需要核心的14个碱基，特异性有待进一步证明。
靶点选择
TALEN靶点常以T为开头，针对某个点来设计工具，TALEN会更加灵活一些。
CRISPR则受限于PAM序列，一般是GG开头的序列，不宜使用U6表达RNA。

5 技术应用
CRISPR系统间区序列的多样性和特异性已被广泛应用于基因分型、流行病学研究、分析不同人体内的细菌菌群差异、检测环境中的噬菌体等科学研究。利用CRISPR系统作用机制的独特性用于构建噬菌体抗性的工业生产菌株。CRISPR系统还可能广泛应用于：作为遗传操作的工具，用于靶向基因沉默；rRNA-Cascade复合物可用于体外DNA、RNA分子的位点特异性切割；在临床上，通过限制质粒结合转移而控制药物抗性基因在致病菌之间扩散等。最近有多项研究都表明，RNA介导的Cas9系统可以被用于对人类和小鼠细胞，以及细菌或斑马鱼胚胎进行基因组改造的工作当中( Martin et al. Science.2012；Mali P，Science.2013；Cong L，Science2013)。图6-图9是应用CRISPR技术进行研究取得成果的论文或评述发表在世界最顶尖期刊中的检索情况，Annual Reviews Series 中22篇，Cell 中13篇，Nature Series 中182篇，Science中31篇。

图6 应用CRISPR技术进行研究的论文或评述发表在Annual Reviews Series中的检索情况

图7 应用CRISPR技术进行研究的论文或评述发表在Cell中的检索情况

图8 应用CRISPR技术进行研究的论文或评述发表在Nature Series中的检索情况

图9 应用CRISPR技术进行研究的论文或评述发表在Science中的检索情况

6 专家评价
CRISPR是一种简单的，在全基因组水平上选择性扰乱基因表达的方法。这一技术提供了一种巧妙的途径来寻找基因组中的所有短DNA序列，然后在序列定位处控制基因表达。该技术使得研究人员能够更容易及精确地追踪基因激活模式，以及在细胞内发生的生物化学连锁事件，并帮助科学家们鉴别正常控制这些事件，且有可能在疾病中出错的关键蛋白。它不同于传统的RNA干扰技术，CRISPR干扰可以同时沉默任意数量的单个基因。此外，它能够更明确地发挥作用，能够极其灵活和快速地将这一机器靶向新位点。且如果你想的话，它能够像RNA干扰一样发挥作用，不会关闭非靶向基因。
——加州大学旧金山分校系统生物学研究人员Lei Stanley Qi博士

CRISPR干扰是在细胞蛋白质制造过程更早的一步发挥作用。利用RNA干扰时，DNA已经转录成了RNA信息。在这个意义上讲，就如同马已离厩为时已晚。利用CRISPR干扰，我们能够阻止信息被读写。
——霍华德休斯医学研究所研究员细胞和分子药理学教授Jonathan Weissman博士

7 主要文献
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