组织化学技术4-酶组化PPT参考课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶组织化学（,Enzyme Histochemistry）,是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定的切片，再一定条件下（具有酶的底物等）全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究。,第二章 酶组织化学,Inruduction,1,1,特点：在原位检测,检测酶的活性而不是酶分子本身,酶的分类：按生物化学分类六大类,氧化还原酶 转移酶,水解酶 裂解酶,异构酶 连接酶,常用检测方法,1沉淀法,金属沉淀法：,Ca,+,Co,法；,Pb,法,偶联法：重氮盐法,靛原法,四唑盐法,2,2,2后偶联法,Post-coupling（ACP）,3,合成法,4底物膜法 设计半透膜 切片/孵育法 影响酶组化实验的关键因素,酶活性的保存,a）,固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不,同的酶适用不同的固定剂,抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金,属盐,Hg、Cr、Pb,等不能用做固定剂。,慎用醛,3,3,b）,取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮氯仿=11）4，510分钟，但脂溶性蛋白脱落。,底物浓度,A）,量要足够120,V/V,B）,孵育法只能用一次，配制,时要适量（节俭）,PH,和渗透压 应以缓冲液调节,温度控制与时间：室温37（40,min）,4（510min）,4,4,捕获剂 亦要求一定浓度，要以反应原位瞬,时沉淀。,激活剂与抑制剂（对照）,a）,两者的选择都应具有特异性。,b）,要有适当的浓度范围,时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一,个很大的范围（指时间），受多种因,素的影响，因药品的质量、环境因素,的变化而变化。故不可轻信之。,扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻,切片孵育尤应注意）,5,5,对照：必须设立对照，以防非特异反应。,这对结果的解释非常重要。,对结果的分析，应考虑如下几个问题：,经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟,能保留多少？,酶是否在原位？,反应中多少酶起了作用？,酶的活性是否代表细胞生活时的活性？,沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延,长，会不会改变？,是否有扩散移位,6,6,一、,钙钴法显示碱性磷酸酶,Alkaline Phosphatase（ALP）,原理,以天然存在的,甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：,7,7,8,方法,标本：,大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）,厚6微米。,固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25,切片标本入下列孵育液中，37，5分钟,孵育液：3,甘油磷酸钠 6,ml,底物,保 2巴比妥钠 6,ml,调,PH,证 2氯化钙（无水）9,ml,沉淀剂,新 2硫酸镁 6,ml,激活剂,鲜 蒸馏水,3,ml,30ml,将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调,PH,至9.4。,9,流水流水洗2分钟后入蒸馏水,入2硝酸钴，5分钟,（小肠可3分钟）,置换,流水洗5分钟，入蒸馏水。,入0.5硫化胺，2分钟。置换,流水洗10分钟，入蒸馏水。,入,Mayer,氏苏木精染液(复染核)1分钟,流水洗5分钟蒸馏水。,甘油明胶或,Apathy,糖胶封固。,10,结果,：,肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛,纹状缘和 血管内皮出现黑色的硫化钴沉,淀，显示,ALP,活性强。,ALP,为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠,绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、,乳腺及 卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。,对照,无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3,甘油磷酸钠，其余各步进行同上。,11,加热灭活酶活性。,加抑制剂，左旋咪唑0.11.0,mmol/L,注意事项,Ca,2+,要足量,硫化钠（,NH,4,）S,配置成淡黄色，可提供,S,2-,滴23滴,用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。,有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色,素）出现，可影响结果。,本法可用显示：5核苷酸酶、肌蛋白,ATPase、ALP,12,二、,铅法显示酸性磷酸酶,（,Gomori，1950 Lojda，1979）,原理,以,甘油磷酸钠为底物，在酸性,PH,下，被,ACP,水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被,S,2-,置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反应式如下：,酸性磷酸酶,Acid Phosphatas（ACP）,13,14,ACP,的特性,PH 4.55.5,适宜,激活剂：,Mn,2+,抑制剂：,NaF，,有些,ACP,为,Cu,2+、,酒石,酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。,ACP,定位,溶酶体（颗粒状）内；,溶酶体外,ACP,存在于,ER,和胞液。,该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、,肾上腺。,15,方法,标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6,微米。,固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可,用甲醛，但影响活性。,本实验不固定或固定于丙酮氯仿（11）,混合液，4，25,min,步骤：,将标本放于下列孵育液中 37，1015,孵育液：0.1,M,醋酸缓冲液，,PH5.2 15ml,0.24,硝酸铅 15,ml,16,3,甘油磷酸钠,3,ml,33ml,混匀，置37水浴中1530分钟后，过滤。,于37蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温,蒸馏水洗）,入5硫化胺，12分钟。,流水冲洗35分钟后，换蒸馏水。,（可用,Mayer,苏木素复染核）,用甘油明胶或,Apathy,氏糖胶封固。,17,结果,酶活性部位棕黑色硫化铅沉淀。,分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细,胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。,对照,孵育液内加0.01,M NaF（13.9mg/,33ml）（）,注意事项,铅离子的浓度 关键问题，没有底物，有,些组织吸附铅离子（+），因此必须用,NaF,抑制酶活性排除假阳性反应。,孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。,18,应用范围,“铅法”适用于：,ACP，5-,核苷酸酶,G6P,酶;膜,ATPase MitoATPase TTPase（,硫胺素焦磷酸酶,）,三、,偶氮偶联法显示,ACP,原理,以奈酚的衍生物磷酸脂,Naphthol ASBL Phosphate,为底物，在酸性,PH（5.2）,下，经酸性磷酸酶水解释放出,Naphol ASBI，,立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。,19,方法,标本：,大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚 6 微米。,不固定或固定于丙酮氯仿（11）混,合液内，4，25,min,标本入下列孵育液，37，3060分钟。,孵育液：磷酸奈酚,ASBI 15 mg,溶于二甲基亚砜 0.6,ml,六氮化对品红 缓冲液,30,ml,30.6,ml,20,充分混匀并过滤,蒸馏水洗,入,Mayer,苏木精内染1分钟。,流水冲5分钟后入蒸馏水。,用,Apathy,糖胶或甘油明胶封固。,结果,酶的活性部位呈红色，核兰色。,分布于肾近端小管核周，肝毛细,胆管周围。,ACP,是溶酶体的标志酶。,六氮化对品红液的配制（30,ml）,21,4对品红盐酸溶液,碱性品红 400,mg,浓盐酸 2,ml,蒸馏水 8,ml,4,NaNO,3,配好后于冰箱保存用时取1,ml。,+等量混匀（各取1,ml），,盖严并置室,温静止一分钟，待混合液变为淡黄色,倒入28,ml 2.72,醋酸钠溶液，用1,N,NaOH,调,PH,至5 5.5即成。,22,四、,四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶,对照,用抑制剂,NaF,浓度为10,mmol/L,Ca,2+,浓度为10,mmol/L,注意事项,六氮盐浓度不能太高,背景会略带黄色,应用范围,本法用于,ALP、ACP、,非特,异性脂酶。,23,原理利用,利用,H,受体的,H,2,，,使四唑还,原成甲,月替,：反应式如下：,24,25,本实验：,以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作,用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（,nitro,BT）,为受,H,体，其接受,H,后被还原成甲,月替,呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。,琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。,抑制物：,丙二酸盐（竞争抑制），磷酸,盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸,（竞争抑制）凡与-,SH,基化合的,作用剂皆抑制其活性。,方法,26,标本,：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后,6微米不固定。,步骤：,将标本放入下列孵育液中，37，约5,分钟。,孵育液：,nitro BT 10mg,0.1MPBS，PH7.8 10ml,PMS（,吩嗪硫酸甲酯）1,mg,徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。,再加入琥珀酸钠 80,mg,蒸馏水洗净,27,Apathy,氏液糖胶封固,结果,酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内,所见蓝紫色颗粒即线粒体。,对照,孵育液去底物，加入等量蒸馏水，同,时孵育（）,注意,甲,月替,易溶于脂，反应扩散时组织内脂滴被染。,加入,PMS（,中间递氢体）定位更加准确。,如果聚乙烯醇,PVA，,可以保护线粒体膜，使,反应局限在线粒体内。,应用范围,适用于：甲胺氧化酶,、,乳酸脱氢,酶,、,琥珀酸脱氢酶。,28,五 、,DAB,法 显示过氧化物酶,原理,过氧化物酶分解,H,2,O,2,的过程中，下面反应不直接发生：,AH,2,（,供氢体）+,H,2,O,2,A（,供氢体的氧化物）+2,H,2,O,2,实验可知，有称为复合物、的酶底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。,29,光镜显示方法,（1,）,孵育液的配置：,预孵育液：,DAB 4HCL 10mg,溶于蒸馏水 5,ml,0.2M,磷酸缓冲液（,PH6.5）5ml,Fahimi,孵育液:,DAB 4HCL 10ml,溶于蒸馏水 5,ml,0.2M,磷酸缓冲液,（,PH6.57.0）,5ml,30,0.3,H,2,O,2,0.1ml,GrahamK,孵育液：,DAB 4HCL 5mg,0.05M TH,缓冲液（,PH7.6）10ml,1H,2,O,2,10ml,Lojda,孵育液：,0.1,N,苯基对次甲苯二胺 25,ml,0.1-,萘酚 25,ml,0.3H,2,O,2,（,新配）1,ml,31,方法,固定：温度4，30分钟（3戊二醛固,定液：20戊二醛15,ml，,或25,戊二 醛12,ml 0.2 M,磷酸缓冲 液50,ml，,蒸 馏水加至100,ml,止）；,洗涤：洗涤三次以上，每次15分钟，或,过滤。,切片：,Cryostat,制成切片（510,m）,染色步骤,切片入下列孵育液中,32,a,预孵液：室温下1030分钟,b,后孵液：,Fahimi,孵育液，室温560分钟,Gropam-Karnovsky,液，室温，310分钟,洗涤：蒸馏水漂洗,染核：亚甲蓝染核,封固：甘油明胶封固,髓性过氧化物酶显示法。,固定与切片：用冷的2.5戊二醛固定30,60分钟，然后用,Cryostat,制成20微米切片。,33,孵育：,Lojda,孵育液，室温，310分钟。,洗涤：蒸馏水洗。,染核：卡红矾染核。,封固：甘油明胶封固。,结果,酶活性阳性部位呈茶褐色。髓性,过氧化物酶蓝色,对照,一般,DAB,法：去掉,H,2,O,2,；,将2050,mM,的3氨基1，2，4三唑加进预 孵育液和,DAB,反应液内。髓性过氧化物酶的显示法：用50,mM KCN,处理。,34,