液相学习心得.doc

 反冲色谱柱是否会降低柱效呢?
                  1. 简单来说，绝大多数硅胶基质的色谱柱,正用反用都是一样,没有多大区别. 反着用也不会对色谱柱柱效产生影响。
                  2. 小心起见的话，建议大家看随色谱柱来的一小页的说明. 上面可能都有注明该色谱柱是否可以反冲.如果没说，一般都是可以反冲的。
                  3. 还有一个问题,就是反冲后，是把柱子调回来用，还是就这么反着用呢？
                    在有些色谱柱压力高的时候，反冲一段时间后，压力下降到正常。换回正常的方向没多久又开始升高，这个时候，可以考虑就将色谱柱反着用。
                  4. 有一种情况下，色谱柱不能长期反冲，就是色谱柱前后筛板孔径不一致的时候。有些3u色谱柱入口筛板孔径可能是2u，出口0.5u。 这样可以让色谱柱承受更大的压力(因为出口比较小)。 这种情况下，反冲一小段时间问题不大，但是时间长了以后，可能造成有些填料被冲出色谱柱，造成柱效下降的情况。如何防止这个问题出现呢？ 还是那句话，看说明书，看手册。
                  RTFM！与大家共勉：）

2011.5.22 要重新开始学习色谱的一些原理和故障诊断，开这个帖子，跟大家分享一下学习笔记。欢迎大家交流。也算是对自己的一种监督。学习资料来自LCGC杂志的各个专栏。

做液相的同学基本都会碰到分叉峰. 很多时候,这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题.这里我们一起看看导致峰分叉的原因以及如何解决这个问题的一些指导性的方法.

1.       首先,我们需要判断,这到底是一个峰,还是两个峰?

A图主峰前面有一个肩峰.这到底是峰形不好,还是另外一个化合物没分开呢?

判断办法:降低该成分在样品中的浓度.

B图是降低该成分浓度后,进样后得到的色谱图.

如果这是一个峰,那肩峰也应该响应变小. 但是,这个例子里,肩峰没有变小,这应该是另外一个化合物.这时候,我们就要考虑如何改变方法,将这两个东西分开.

2.       所有峰的峰形都不好.

一般来说,一个样品都会出多个峰. 峰形不好,绝大多数时候,在每个峰上面都会出现. 比如像下面这样:

A图是所有峰都拖尾.

B 图是所有峰都有肩峰,也可以说峰分叉.

这种情况一般都是色谱柱头塌陷或者柱头的筛板被堵导致的. 为什么导致峰型问题呢? 请看下面的图.

A图是正常的柱头.B图是筛板被堵的柱头.

正常情况下,所有样品分子都是均匀通过色谱柱的,形成一个对称的峰形.

堵塞得情况下,有一部分样品分子进入色谱柱就会收到阻扰,导致时间拖后,形成拖尾.

对于色谱柱塌陷的情况,用同样的方法,大家也不难理解.只不过这时候,是一些样品分子可能跑的比正常的快了一些.

如何解决这个问题呢:

1.       反冲. 柱出口放空，冲20-30ml流动相。 虽然柱子上都有表明使用方向, 但是对于硅胶基质的色谱柱,基本都可以反冲.

将柱头污染物(泵密封圈的碎屑，样品中的污染等)冲走，就能解决问题。当然，还是要提倡大家注意样品上机之前的前处理和及时更换磨损的泵密封圈。有条件的，还是用保护柱，大不了就换保护柱，也比换色谱柱强。

2．更换或清洗筛板。现在估计做这个事情的人不多，但是谁有废柱子，想练练也未尝不可。

案例分析：

我们一起看看一个实际的例子。

根据之前说的，可能是柱头堵了，或者塌陷了。但是进一步检查，发现另有原因。

方法用的150 mm  4.6 mm, 5- um C18 柱子，78% 乙腈，1.5ml/min，等度方法，进样10ul，100%乙腈溶解的样品。

一般来说，虽然10ul的纯乙腈不会引起峰形不好，但是有时候样品溶剂的极性跟流动相差异较大时，的确会引起峰形的问题。

我们怎么办呢：

1．  从最容易的办法做起，降低溶剂乙腈的比例。降到50%看看。从下图B，4min的峰可以看出，没啥改观。

2．  接下来反冲柱子，结果图C，基本没变化。算，每天再说吧。

3．  第二天来到实验室，还能干嘛呢？ 更换筛板？ 算了，直接换柱子吧。结果如D，噢，好很多噢。之前柱子肯定有问题，扔了。但是峰还是有点宽，估计还是哪儿有问题。

4．  手上忙，没时间管这个。几天过后，重新配了流动相，一跑，好了。如图E。

虽然到底什么原因导致的之前峰形的问题已经无从查找(柱子扔了，旧流动相也没了)，但是也给我们一个解决问题的步骤：

1．  确定峰形问题是所有峰都有问题，还是就是某一个峰有问题。如果所有峰都有问题，基本都是色谱柱，或者仪器管路连接的问题。如果是某一个峰有问题，那就要从方法上来考虑，是否需要改变流动相比例，pH值，色谱柱温度等等。

2．  从最简单的做起，从不需要换什么东西的方法做起。比如改变样品溶剂，反冲色谱柱等等。

3．  换东西。换保护柱，换色谱柱，换流动相(新配)。一步一步的换，有助于找到问题的根本。

4．  问题解决后，想想需不需要采取什么措施，防止类似问题的发生，比如说常换流动相啦，即时更换密封圈啦，记录进样次数了解什么时候色谱柱就不行了啊之类的

基线噪音是做液相的同学经常感到头疼的问题, 特别在做痕量分析时候. 这次我们从物理,化学到电子等各个方面看看噪音的来源,以及如何减小和消除噪音.

1.       流动相的在线混合.

所有的流动相在线混合都是从方便出发的结果, 流动相混合的不充分是基线噪音的一个重要来源.混合方式主要两种:

a.       低压混合：采取时间脉冲的方式，利用比例阀，将不同流动相按一定比例混合。

b.       高压混合：利用多个泵头，控制每个泵的流量，来将流动相按一定比例混合。

在流动相混合后，一般都有一个混合器(Mixer),来帮助混合的更加充分。从流动相开始混合在一起，到流动相到达色谱柱头，这一段体积叫做延迟体积(Delay Volume). Mixer体积越大，混合越好，但是相应延迟体积就越大，造成梯度的延迟。换句话说，就是流动相的变化，需要一定时间后，才能真正到达色谱柱对分离产生影响。

a.       这个现象在使用UPLC或者UHPLC的时候，会有比较明显的作用。

b.       为什么相同梯度方法，在不同仪器，或者不同品牌的仪器之间转化时，保留时间可能不一样？ 其主要原因就是延迟体积的不同。

在线混合很难做到非常均一的混合效果，这个在示差检测器（RID）上的效果最明显。这也是为什么示差检测器都要求将流动相预混到一个瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何减小因为混合而造成的基线噪音呢？

a.       对于等度的方法，非常简单，预混流动相就可以了。

b.       对于梯度的方法，部分预混流动相也会帮助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。

方法要求乙腈/水比例从10%走到85%。 那可以将流动相A配成10%的乙腈，流动相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度从0%走到100%。 这就是部分预混。

c.       增大Mixer的体积。一般mixer的体积从几百ul到几个ml都有，在允许的延迟时间下，更换一个体积更大的Mixer，能够有效提高混合的效率。每个色生产厂家的Mixer体积都不一样,基本都可以混用.有碰到过一个Agilent的1100基线噪音大,后来换成1050的mixer就好了,因为1050的mixer比较大一些.

2．液相硬件问题造成的基线噪音。

   如果液相系统某些地方的工作不正常，也可能造成基线的噪音。

a.       系统有漏。特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏，会造成流速的变化和混合比例的变化，从而导致基线噪音。检查的方法就是对系统进行压力测试：将系统从某个地方用死堵堵上，如泵出口，或者自动进样器出口，将压力升高到350bar后停泵，监测压力下降的情况。一般的标准是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b.       梯度比例问题。可以对系统进行一个梯度测试，来检查梯度混合是否准确和一致。将A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波长下，将A的比例10%，20%，30%这样一个一个的升高每个比例走3min。可以根据计算，看每个基线台阶上升是否准确。 也可以从0-100%走一个连续的梯度，看基线上升的平滑性和线性。

3．流动相脱气不好造成的基线噪音。

   对流动相进行脱气，不仅仅是为了防止系统里面气泡的产生。 流动相脱气越好，基线就会越好。如今最常用的脱气方式是在线脱气机，但是有的时候脱气并不彻底。所以当有基线噪音问题是，可以考虑采取多种的脱气方式。

4．系统洁净程度。

   前面1-3点讲的都是内在原因，造成的基线噪音或者波动。如果你前面的原因都找过了，问题还没有解决，就得考虑一下是不是流动相里面是否有杂质了。如何检查判断是否为流动相的问题呢？

a.       每次更换一种流动相，看基线结果。

b.       重新配置所有流动相。这种方式比较快，但可能无法找到根本原因。

要特别注意在流动相的配置过程中，是否引入了污染，比如使用了不干净的玻璃器皿什么的。更换溶剂的品牌和批次也是方法之一。

色谱柱长期使用造成的污染有时候也会造成基线波动。有些时候样品里面可能有些保留非常强的组分，可能在色谱柱上很长时间才慢慢被冲出来，这时候已经不是一个峰了，而是基线的干扰或者波动了。

避免这种问题的方法：在每批样品后，用甲醇或者已经长时间冲洗色谱柱。另外，专柱专用也是一个好的习惯。如果一根色谱柱上作很多不同的样品，也可能导致互相之间的污染和影响。

5．电路的噪音。

   对于UV检测器来说，就是采样频率不合适而产生的噪音。现在随着超高效液相的普及，检测器的采样频率也越来越高，有的可以达到80Hz以上。但是如果一味追求高采样频率，可能对灵敏度没有任何帮助，反倒产生比较大的噪音。(我们后面可能会有一起专门检测器的时候,会更详细的讨论这个的原因)

一般来说，我们需要保证一个色谱峰上面有15-20个点，来保证比较平滑的峰形和比较准确的定量结果。如果我的一个峰的时间宽度是0.5min，就是是30s，那只要保证1Hz的采样频率就足够了。如果在UPLC上面，一个峰的时间宽度是0.05min，也就是3s,就需要10Hz以上的采样频率。 那80Hz的采样频率什么时候用呢？ 你的一个峰只有0.5s的时候。

理论上的计算是这样的

N=16（T/W）^2

N是柱效。T是保留时间。W是峰宽。

一般色谱如果柱效12000的塔板数。在5min的时候，出峰宽度大概计算出来时11s。你可以根据计算结果来调整检测器的合适的采样频率。