响应面法优化桔梗发酵工艺初探.pdf

第 卷 第 期 年 月绵阳师范学院学报(自然科学版)().收稿日期:基金项目:绵阳师范学院教育综合改革项目()绵阳师范学院新农科研究与实践项目()第一作者简介:姜立春()男吉林梨树人教授博士研究方向:生物化学与分子生物学 响应面法优化桔梗发酵工艺初探姜立春张雨洁刘钰佳刘静凤刘春秀梅青刚(绵阳师范学院生命科学与技术学院四川绵阳)摘 要:以桔梗为原料基于单因素试验考察酵母接种量、料液比、发酵时间、发酵温度和 对桔梗微生物发酵工艺的影响利用响应面法构建了发酵时间、发酵温度、三因素三水平的回归模型并以总黄酮含量和酒精度作为响应值 结果表明:回归模型具有较高的显著性确定了微生物法发酵桔梗最优条件为:发酵时间 、发酵温度 和 为 在此条件之下终产物中的总黄酮含量和酒精度分别为./和.响应面法优化得到的工艺条件合理可靠是有利于桔梗发酵工艺的可行方法 关键词:桔梗 总黄酮 工艺优化 响应面法中图分类号:文献标志码:文章编号:():././.():.:./.:引言桔梗(.).)为桔梗科桔梗属的一种植物其干燥根部是一味重要中药材 桔梗属性温和味甘、苦、辛辣具有祛痰、止咳、促进吞咽、化脓的功效 医学研究表明桔梗富含多糖、三萜皂苷、脂肪酸、黄酮等多种物质其中黄酮属酚类物质具有抗氧化、抗衰老、抗炎抑菌、促进血液循环、降血脂等生理功效 桔梗作为食品原料可加工成桔梗蔬菜、桔梗丝等食品口感鲜美 由于桔梗药食两用的双重特性其广泛运用于医药、日化、食品等多个化工领域且国内外市场对黄酮需求量逐渐上升 目前桔梗发酵工艺运用广泛且提取总黄酮的工艺方法较多其主要包括微波提取法、亚临界水法、超声提取法等物理方法还有酶辅助法、微生物法等生物方法 此外对于桔梗总黄酮提取的优化工艺范树国等采用正交设计法钟方丽等采用微波协助双水相法等 迄今为止应用响应面法优化桔梗总黄酮发酵工艺的研究较少 本研究通过利用微生物法(葡萄酒活性干酵母)发酵桔梗基于单因素试验并应用响应面法探究其发酵工艺的最优条件进而提高桔梗总黄酮的提取量以探索低成本、高效率、高质量的桔梗总黄酮发酵工艺为进一步利用桔梗资源提供有益的借鉴 材料与方法.原料与试剂 年生桔梗采集于安徽毫州(圆柱形或纺锥形、长 直径.表面灰白色或浅黄色)、葡萄酒活性干酵母(湖北安琪酵母公司)、芦丁标准品(成都仪睿生物科技有限公司)、其余均为国产试剂分析纯.仪器与设备高速冷冻离心机(盐城市凯特实验仪器)型电子分析天平(杭州欧尔柏维科技有限公司)型恒温振荡培养箱(广州市怡华新电子仪器有限公司)型紫外可见分光光度计(深圳埃科瑞仪器设备有限公司)型电热恒温水浴锅(河北祺胜仪器制造有限公司).试验方法.桔梗发酵工艺 工艺流程:挑选大小均匀、无虫蚀、无霉变的桔梗用流水洗净去皮切片后粉碎为 目按照料液比调整成分再接种活化酵母菌液进行发酵处理 发酵一段时间后进行离心静置过滤最后杀菌得到成品.总黄酮含量的测定 参考曾玲等的方法制备分别以芦丁质量浓度(/)、吸光度为横纵坐标的标准曲线并以此计算总黄酮含量 总黄酮含量/()/()式中:为由标准曲线所得的总黄酮的质量浓度(/)为待测样液定容后的总体积绵阳师范学院学报(自然科学版)()为稀释倍数为待测样液测定吸光度所用的体积().酒精度的测量 参照密度瓶法测量 时的样品密度查酒精水溶液密度与酒精度对照表得到该温度下样品的酒精度 其计算公式为:().()式中(注:为前提条件):为样品密度(/)为蒸馏水密度(./)为干燥空气在.条件下的密度(./)为密度瓶的质量()为密度瓶和水的质量()为密度瓶与试样的质量()为空气浮力校正值.为蒸馏水和干燥空气的密度值之差(/).单因素试验 维持桔梗发酵无关因素一致条件下分别探究接种酵母质量分数(.、)料液比(、/)发酵时间(、)发酵温度(、)(、)对桔梗发酵总黄酮含量和酒精度的影响.响应面试验设计 依据大量的文献资料基于单因素试验选定发酵时间()、发酵温度()和()为主要影响因素并以桔梗发酵的酒精度()和总黄酮含量()为响应值应用.软件并根据 试验原理进行三因素三水平的响应面试验设计进一步探究桔梗发酵工艺最佳条件具体试验设计内容见表 图 下芦丁溶液标准曲线.结果与分析.芦丁标准曲线及回归方程如图 所示拟合标准曲线求出线性回归方程:.结果显示:芦丁质量浓度与吸光度在./内展现出较好的线性关系.单因素试验结果.酵母接种量对桔梗发酵的影响 由图 可以看出:接种酵母质量分数为 时总黄酮含量达到最高而酒精度始终保持递增状态 随着酵母菌质量增加发酵液中养分供给会逐渐减少且溶氧量也将逐渐降低继而影响酵母菌生长 因此酵母接种量为 时效果最佳在该条件下酵母菌不仅具有较强的新陈代谢能力还能促进发酵液中的酚类物质的溶解.液料比对桔梗发酵的影响 由图 可以看出:总黄酮含量和酒精度分别在料液比为 、/时达到最大值考虑到料液比偏大会导致浸提后的黄酮转移至液相中不利于分离纯化 因此选取液料比为 /进行试验 姜立春等 响应面法优化桔梗发酵工艺初探 图 酵母接种量对桔梗发酵的影响.图 料液比对桔梗发酵的影响.时间对桔梗发酵的影响 从图 可以看出:总黄酮含量和酒精度走势基本是一致的呈正比关系 二者先随着时间延长增加至 时含量最高随后不断减小且发酵时间为 时总黄酮含量相对较高其原因可能是随着发酵天数的延长酵母菌大量死亡发酵液中的酚类化合物发生自然氧化以及微生物所产生的代谢物如酶类促使黄酮降解降低其含量 因此后续发酵条件优化的试验中可将发酵天数控制在 .温度对桔梗发酵的影响 由图 可知:发酵温度对酵母菌的生长代谢和繁殖能力以及黄酮、酒精的溶解度均会产生直接影响 总黄酮含量和酒精度在 之间不断增加在 时达到最大值分别为./、.发酵温度超过 后总黄酮含量相较于酒精度缓慢减少 故后期试验发酵温度设定为 图 时间对桔梗发酵的影响.图 温度对桔梗发酵的影响.图 对桔梗发酵的影响.对桔梗发酵的影响由图 可知:为 时总黄酮含量和酒精度达到最大值且二者变化趋势基本一致酒精度对总黄酮提取具有正向促进作用其原因可能与酵母生长所需适宜的 相关 因此在后续优化实验将 规定为.响应面试验结果.响应面模型的建立与显著性检验 使用.软件应用 试验原理根据.响应面试验设计设计结果见表 并对其试验绵阳师范学院学报(自然科学版)数据采用多元回归分析分别获得、的回归模型方差分析结果(见表 和表)再经多元线性回归方程拟合所得结果如下:.().()由表 和 可得酒精度()的回归模型显著性结果显示.为极显著即三因素、与酒精度之间的线性关系极显著总黄酮含量()的回归模型显著性结果表明.均为不显著故而试验模型可靠 两个模型的校正决定系数为().().表明两个模型均具有较高的拟合度与实际试验较为吻合 此外、模型的 值分别为.、.在误差允许范围内由此可应用本试验所得拟合回归方程来替代试验真实点对桔梗发酵过程中的酒精度和总黄酮含量进行推测和分析 根据回归模型显著性结果显示:对于酒精度()一次项不具显著性二次项为极显著性交互项又不显著则能够说明、三者之间的交互作用不显著因此在采用该拟合回归方程模型时可以不用考察该三因素之间的交互作用 对于总黄酮含量()一次项和二次项均无显著性但 间交互作用显著由此在应用该模型时需要考虑到 间的交互作用 姜立春等 响应面法优化桔梗发酵工艺初探 图 三因素交互作用对桔梗总黄酮和酒精度影响的响应面图.响应面三因素间交互作用分析、三者间交互作用对桔梗发酵的总黄酮含量和酒精度的影响如图 由图 可知在 模型中 所构成的响应面坡度相对较陡等高线为椭圆形且从表 可知其 值为差异显著说明 间的交互作用对总黄酮含量有显著影响 其余的响应面坡度均较为平缓等高线近圆形且据表 和 可知其 值均为差异不显著表明、三者间的交互作用对酒精度影响较小且、间的交互作用对总黄酮含量影响不显著.验证试验使用.软件分析得到桔梗总黄酮提取量的理论最佳值为./其对应的最优发酵条件为:发酵时间为.、发酵温度为.、为.且在该条件下的酒精度为.但对于实际操作可行性而言将最佳发酵条件调整为发酵时间为 、发酵温度为、为.且在该条件之下进行 组重复试验所测得的总黄酮含量平均值./、酒精度平均值为.分别比理论值低.和.该差异值在可接受范围之内所以利用响应面法优化桔梗发酵的工艺条件是可靠的 讨论本试验利用微生物法(葡萄酒活性干酵母)进行桔梗发酵与许佳达等人红枣果醋酒精发酵优化工艺的研究中的菌种选择具有相似性 酵母代谢物中包含各种酶类可以有效代替酶解法操作简单易行但该法可控性差影响酵母生长与繁殖的其他因素如溶解氧含量、罐压等都还有待于考究 同时总黄酮含量测定采用的是硝酸铝法 该方法与氯化铝法、盐酸水解 相比较其准确度还存在一定的差距 此外酵母代谢会产生酒精且酒精度会影响总黄酮含量因此有必要对酒精度也进行考究其测定方法主要有密度瓶法、数字密度计绵阳师范学院学报(自然科学版)法等 本试验采用密度瓶法进行该法对各种仪器的品类以及温度等有较严格要求因而酒精度测定存在一定的误差 随着科学技术的进步酒精度的测量趋于简单快捷例如京都电子工业公司研发的“酒精度测定仪”以震动法测量酒精度并能防止产品中其它成分的干扰准确性也得以保证 此外本试验使用了 糖水活化葡萄酒活性干酵母研究表明糖度对酒精度的测定具有一定的影响本试验利用响应面分析法优化桔梗发酵工艺条件该法不但可以探究因素与因素之间、因素与响应值之间的交互关系得到正交试验的最优因素水平组合同时还可以在整个区域上找到因素的最优组合以及响应值的最优值 本探究与许佳达等人在发酵温度上的研究具有相似性发酵时间与于婷等人研究结果基本一致 目前关于发酵 的研究较少大部分都是以 作为评价指标于婷等人研究表明菌种的生活最佳 为 左右 因此本次试验结果与大部分的研究结果是相符合的具有可靠性 结论本研究以桔梗为原料基于单因素试验探究五因素对桔梗微生物发酵(葡萄酒活性干酵母)的影响并以响应面分析法加以优化确定了提取桔梗总黄酮的最佳工艺条件为:发酵时间为 、发酵温度为 、为 在此发酵条件下所测得的总黄酮含量和酒精度分别为./和.相较于理论值而言仍在可接受范围内 本试验利用响应面法优化桔梗发酵的工艺条件是合理可靠的且节约资源、绿色环保、操作便捷并能使植物的天然活性成分得到高效保护可为桔梗以及其他植物资源的黄酮提取实现综合利用提供有价值的经验借鉴 参考文献:.(.).:.:.():./.():.周新崇易灿刘进兵.微波辅助提取崀山脐橙皮总黄酮及生物活性研究.邵阳学院学报:自然科学版():.:.张展适.辣木叶中总黄酮超声提取工艺优化.广州化工():.().:.鲁青严美婷张超凤等.微生物发酵技术同步提取青钱柳多糖和黄酮.食品与发酵工业():.范树国何润兰邱璐等.桔梗总黄酮含量的测定.江苏农业科学():.(下转第 页)姜立春等 响应面法优化桔梗发酵工艺初探 图()()随着时间 的变化图.()()结语本文研究了在时滞干扰下随机多斑块模型的识别问题.主要是利用了 稳定性理论和图论方法.文中利用的时滞为常时滞若考虑时变时滞能否成功识别这是未来需要研究的问题.参考文献:.:.:.:.夏丹.随机多扩散的多斑块模型的拓扑识别.成都:西南交通大学.:.():.(责任编辑:陈英)(上接第 页)钟方丽王文姣王晓林等.微波协同双水相提取桔梗茎总黄酮及抗氧化活性研究.食品工业科技():.周瑶徐怀德米林峰等.响应面法优化黄芪酒发酵工艺.食品科学():.曾玲刘金熙朱爽等.桔梗提取液经微生物发酵后抗氧化能力研究.延边大学农学学报():.中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定:.北京:中国标准出版社.():.许佳达高绮君黄瀚文等.红枣果醋加工工艺研究.现代农业科技():.赵振刘霞黄昭等.苎麻籽总黄酮含量测定方法比较研究.食品安全质量检测学报():.余妍佳张清安王扶香等.基于国标法测定模型酒液的酒精度及其影响因素研究.农产品加工():.孙晓春黄文静任飞.桔梗总黄酮提取工艺优化及其体外抗氧化性.北方园艺():.于婷.发酵对桔梗降血糖主要成分的影响及降血糖作用研究.延吉:延边大学.(责任编辑:陈桂芳)绵阳师范学院学报(自然科学版)