兔眼角膜着染对眼刺激性试验结果评价的影响.pdf

Jun.2023,43(3)DOl:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.169兔眼角膜着染对眼刺激性试验结果评价的影响徐红花，金天，王海，沈梦莹 2，玉瑞，周艺佳，谭莹12(1.云南省药物研究所，昆明6 50 111；2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，昆明6 50 111)摘要目的观察正常实验兔眼经荧光素钠染色后的着染现象对眼刺激性试验结果评价的影响。方法在进行针对氯化钠滴眼液、四味珍层冰硼滴眼液、玻璃酸钠滴眼液、色甘酸钠滴眼液和复方门冬维甘滴眼液的实验免眼刺激性试验（每组4只，雌雄各半）中，将给予生理盐水的兔左眼（自身阴性对照）和给予药物制剂的右眼（给药实验）进行1%荧光素钠染色，然后用裂隙灯显微镜连续31d观察免眼刺激反应并评分，记录免角膜上皮着染的形态变化并计算着染发生率。观察结束后对眼球及哈氏腺进行组织病理学检查，并将左眼着染发生率检查结果与给予相应药物的右眼进行统计学对比分析。结果给予生理盐水的左眼和给予药物制剂的右眼均无眼刺激反应，评分均为0，角膜着染总发生率分别为3%、1%，左右眼每天和总着染发生率无明显差异（P0.05）。角膜上皮着染形态有单点状着染、散在点状着染、局限性着染和大片融合着染的无规律变化，眼球及哈氏腺未见组织病理学改变，结果评价为无刺激性。结论实验免眼无规律间断出现的角膜上皮着染对眼刺激性试验的结果评价无影响。【关键词】实验免；角膜；着染；眼刺激性试验；结果评价中图分类号】R-332；Q 95-33文献标志码】A【文章编号 16 7 4-58 17(2 0 2 3)0 3-0 30 7-0 7Influence of Corneal Staining in Rabbits on the Evaluation of EyeIrritation Test ResultsXU Honghua2,JIN Tian2,WANG Hai2,SHEN Mengying2,WANG Rui2,ZHOU Yjia2,TAN Ying?(1.Yunnan Institute of Materia Medica,Kunming 650111,China;2.Yunnan Province Company Key Laboratory forTCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111,China)Correspondence to:TAN Ying(ORCID:0009-0007-3084-9020),E-mail:ABSTRACT Objective To observe the influence of the staining phenomenon after fluorescein sodiumstaining on eye irritation in normal rabbits.Methods In the experimental rabbit eye irritation testconducted with sodium chloride eye drops,Siwei Zhenceng Bingpeng eye drops,sodium hyaluronate eyedrops,sodium cromoglycate eye drops,and compound aspartate eye drops(4 in each group,half male andhalf female),the left eyes of rabbits were administered normal saline(self-negative control)and the righteyes were administered the experimental medicine;the eyes were stained with 1%sodium fluorescein,andeye irritation was observed and scored using slit lamp microscope for 31 days.Morphological changes ofcorneal epithelial staining were recorded and the incidence of staining was calculated.After theobservation,the eyeballs and Hasselblad glands were examined histopathologically,and the staining rateof the left eye was compared with that of the right eye which was administered the correspondingmedicine.Results Neither eye had any irritation symptoms;the scores were O,and the total incidences ofcorneal staining were 3%(left)and 1%(right),respectively.There was no significant difference between thetwo groups(P 0.05).Corneal epithelial staining showed single-spot staining,scattered dot,localized,orlarge areas of fusion staining.No histopathological changes were found in the eyeballs or Hasselbladglands,and the results were evaluated as non-irritative.Conclusion The irregularity of corneal epithelialstaining in rabbits did not influence the results of the ocular irritation test.Key words Rabbits;Cornea;Staining;Eye irritationtest;Result evaluation【基金项目】云南省药物研究所第三方公共技术服务平台能力提升建设（2 0 2 10 4AR040002)第一作者】徐红花（197 8 一），女，本科，高级工程师，主要从事药物安全性评价研究。E-mail：6 0 11396 54 q q.c o m通信作者】谭莹（197 9）,女，博士，高级工程师，研究方向：药物安全性评价研究。E-mail：t a n y i n g y n b y.c n。O RCID：0 0 0 9-0 0 0 7-30 8 4-9020实验动物与比较医学LaboratoryAnimaland ComparativeMedicine307动物实验技术与方法Animal Experimental Techniques and Methods308实验兔眼刺激性试验一直以来是评价眼刺激的常用方法，其主要用于评估药物制剂或化妆品等经眼给药或可能接触到眼后对眼局部产生的刺激性，该试验是临床前安全性评价的组成部分，结果可为药物制剂或化妆品的临床使用提供安全性依据【1-2 。由于实验动物“3R”原则的实施，以及在体眼刺激性试验数据具有主观性强、不易测量等缺点，体外替代方法逐渐成为眼刺激性评价研究的发展方向【3-4。近年来通过体外试验方法研究发现，体外试验虽有优势，但也存在无法模拟神经调节、吸收、分布和代谢等复杂体内环境的缺陷。迄今为止，还没有一种体外方法能够完全替代体内眼刺激性试验5。因此，体内眼刺激性试验仍是经典的评价方法之一，但需要不断优化在体眼刺激性试验的方法，总结试验中影响结果评价的因素和经验，提高在体眼刺激性试验结果的准确性。本研究观察实验兔眼刺激性试验中角膜经荧光素钠染色后着染现象的发生发展过程，探讨其对体内眼刺激性试验结果评价的影响。1材料与方法1.1实验动物45月龄的普通级新西兰白兔2 0 只，雌雄各半，体质量为2.8 3.5kg，由青岛艾莱克生物科技有限公司提供SCXK（鲁）2 0 190 0 0 6 ，质量合格证编号为N0.370839200100002171。动物饲养于云南省药物研究所药物安全性评价中心的普通级动物实验室SYXK（滇）K2017-0004，环境温度为18 2 4，相对湿度为40%7 0%，照明条件为12 h：12 h(0 8：30 2 0：30）明暗交替，实验动物可自由饮水，每日饲喂兔生长繁殖配合饲料（批号：2 2 0 14111）2 次，上午喂饲约50g，下午喂饲约10 0 g。动物实验方案经云南省药物研究所实验动物管理与使用委员会（IACUC）审查通过动（伦）IACUC-2022-0011-01。1.2药品与试剂氯化钠滴眼液（山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号2 2 0 30 2）；四味珍层冰硼滴眼液（江西珍视明药业有限公司，批号2 2 0 40 1）；玻璃酸钠滴眼液（德国URSAPHARMArzneimittelGmbH公司，批号30 2 57 5);色甘酸钠滴眼液（武汉五景药业有限公司，批号22010403)；复方门冬维甘滴眼液【曼秀雷敦（中国药业有限公司，批号2 2 8 111；生理盐水即0.9%氯化钠注射液（昆明南疆制药有限公司，批号A22012503实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineJun.2023,43(3)B)；荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司，批号12 12 10 1）；舒泰50（法国VIRBAC公司，批号8EM1A）；改良Davidsons液为实验室自配（10%中性缓冲福尔马林液、无水乙醇、乙酸、自来水按6：3：1：10比例混合）；甲醛溶液、无水乙醇和乙酸均购于国药集团化学试剂有限公司；HE染色剂为实验室自配（苏木红1g加10 mL无水乙醇溶解，硫酸铝钾2 0 g加纯水200mL溶解，两液混合加热煮沸，加2 g氧化汞后冷却过滤，使用前每10 0 mL加入冰醋酸6 mL和甘油10 mL)。1.3主要仪器裂隙灯显微镜（杭州爱视界医疗器械有限公司，型号ML-350S）；组织切片机（型号RM2255）、包埋机（型号EG1160）、脱水机（型号ASP300S）、染色机（型号ST5020）和光学显微镜（型号DM6000B、DM500）均为德国Leica公司产品；数字病理切片扫描仪（宁波江丰生物技术公司，型号KF-PRO-005）。1.4荧光素钠染色液的配制方法用一次性注射器抽取规格3mL：0.6 g（2 0%）的荧光素钠注射液0.1mL于离心管中，再加入1.9mL氯化钠注射液，混匀后即是1%荧光素钠染色液。每天在超净工作台现配，配制后常温下使用。1.5动物分组与给药实验兔在给药第1天分组前用1%荧光素钠进行双眼染色，染色后10 min内用裂隙灯显微镜检查，排除有眼睛刺激症状、角膜缺陷、着染和结膜损伤的动物6 。检查后2 0 只动物均合格，随机将2 0 只实验兔分为氯化钠滴眼液组、四味珍层冰硼滴眼液组、玻璃酸钠滴眼液组、色甘酸钠滴眼液组和复方门冬维甘滴眼液组，每组4只，雌雄各2 只。分组后，采用同体自身对照法，动物左眼给予生理盐水（阴性对照），右眼给予上述对应的滴眼液药物制剂（实验给药）【7-8 ，每眼每次滴人0.0 5mL的相应药物或生理盐水，每天6次，每次间隔1h。以后每天均按上述给药方法，连续给药2 8 d，停药恢复观察3d。每天首次给药前和恢复期间，左右眼均进行1%荧光素钠染色并检查1次，给药期间检查完后即开始给药。1.6目眼刺激反应的观察及评分每天第1次给药前和恢复期间，将实验兔固定，拉开下眼脸，左右眼各滴入1滴（约0.0 2 mL）1%荧光素钠溶液染色，染色后10 min内用裂隙灯显微镜观察实验兔双眼角膜、虹膜、结膜的眼刺激反应并评分，Jun.2023,43(3)拍照。眼刺激反应的评分标准见表1。将每一个观察时间、每一只实验兔的眼刺激反应分值相加，最大总积分为16 分。各组实验兔每天积分相加得到总分值，再实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine激性；13 16 分为重度刺激性。309除以每组实验兔数量得到每组平均分值。根据最后的平均分值判断各组实验兔的左右眼刺激性：0 3分为无刺激性；48 分为轻度刺激性；9 12 分为中度刺表1兔眼刺激反应分值标准Table1 The standard scores for eye ocularirritation in rabbits刺激部位Site of irritation角膜Cornea虹膜Iris结膜Conjunctiva最大总积分Maximumtotalintegralvalue眼刺激反应Reactionto eye irritation无混浊散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见半透明区易分辨，虹膜模糊不清出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见角膜不透明，虹膜无法辨认正常皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应出血，肉眼可见坏死，对光无反应(或其中一种）血管正常血管充血呈鲜红色血管充血呈深红色，血管不易分辨弥漫性充血呈紫红色无水肿轻微水肿（含眼脸）明显水肿伴部分眼脸外翻水肿至眼脸近半闭合水肿至眼脸超过半闭合无分泌物少量分泌物分泌物使眼脸和睫毛潮湿或黏着分泌物使整个眼区潮湿或黏着分值Score012340120123012340123161.7目眼角膜上皮着染情况检查试验期间，实验兔眼角膜每次染色后，用裂隙灯显微镜的钴蓝光检查左右眼角膜上皮被着染为黄绿色6 的动物数和着染形态，计算实验兔每天着染的发生率，以及观察期间出现着染动物的总发生率。1.8解剖肉眼观察及组织病理学检查第31天染色检查后，用舒泰50 按8 mg/kg的剂量经耳缘静脉注射麻醉实验兔。股动脉放血处死后，肉眼观察阴性对照动物眼的外观情况。摘取眼球和哈氏腺，用改良Davidsons液固定48 h，然后采用常规的HE染色法进行组织病理学检查。1.9统计分析方法运用IBMSPSSStatistics24软件进行统计分析。采用检验比较给予生理盐水的实验兔左眼和给予药物制剂的实验兔右眼的每天着染发生率和总着染发生率，以P0.05）。Note:The same body self-contrast method was used.Normal saline was administered to the left eye and experimental medicine wasadministered to the right eye.All eyes were stained with 1%sodium fluorescein before daily administration.D1-D31 refer to the 1st to 31stdays after staining,and the daily incidence is the number of animals per day/total number of animals.The total incidence rate wascalculated as the number of stainings/total examinations performed during the observation period(in each group,n=4x31 d-124;total n=20 x31 d=620).The Chi-square test showed no significant difference in the incidence of daily or total staining between the left and righteyes(P 0.05).2.3目眼角膜解剖后肉眼观察及组织病理学检查情况在第31天染色观察结束后解剖，肉眼观察2 0 只试验兔的左右眼外观均未见异常。对摘取的眼球（含角膜和视网膜）及眼附属器哈氏腺进行组织病理学检查，结果发现左右眼的角膜、视网膜、哈氏腺等组织结构及其细胞形态均未见异常（图2)。3讨论在体内眼刺激性试验中，着染是荧光素钠在不光滑的眼角膜上滞留，通过裂隙灯显微镜在钴蓝光下观察到的一种现象，也叫荧光素滞留或染色。临床上认为，角膜上皮着染是由泪膜不稳定导致角膜上皮损伤所致9-1，其中眼干燥症也是泪膜不稳定引起的症状之一12 。在评价以眼角膜损伤为主的受试物时，往往将着染现象作为评价眼角膜损伤的指标之一13。然而实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine观察部位D1D3D9D10D12D17D18 D20D24D28D31incidence/%002502500025002500000000000010010Jun.2023,43(3)片融合着染，个别时间左眼的着染面积更大，程度更重。结果见表2，图1。每天发生率/%02500025000250000250002500102000角膜作为最先与药物接触的组织更易受到损伤，非药物的其他原因也可能导致着染现象而影响实验结果的评价。因此，在体内眼刺激性试验中，观察着染的变化情况及影响因素，对客观评价受试物的眼刺激性显得非常重要。本研究结果表明，实验兔入组前左右眼检查均无角膜上皮着染，但在观察期间，给予0.9%氯化钠注射液的左眼出现了着染，其发生率（3%）略高于给予药物制剂的右眼（1%），且左右眼出现的时间均呈间断无规律变化；另外，眼角膜组织病理学检查未见异常，结果评价为无刺激性。由此表明正常实验兔在非药物原因影响下也会出现无规律变化的角膜上皮着染现象，该现象对结果评价无影响。本实验结果提示，在实验兔眼刺激性试验中，当给药组动物的眼角膜上皮出现着染时，需根据发生率、持续时间、变化规律和着染程度等与阴性对照进行比较分析后再做客观评价。若Total002502525002500250000001025000250250025000025000250002010100002500000000250100100O000000002500025003.22.42.41.62.40.82.40.82.40.83.01.0Jun.2023,43(3)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine311ARRRD3BD17D18D28D9D10D12D20注：A，不同时间的右眼（给药）着染形态汇总：第3天（D3），散在点状着染；第17、18、2 8 天（D17、D 18、D 2 8），局限性着染。B，不同时间的左眼（阴性对照）着染形态汇总：第9天（D9），单点状着染；第10、12、2 0、30 天（D10、D 12、D 2 0、D 30），局限性着染；第2 4天(D24），大片融合着染。Note:(A)The morphology of staining in the right eye at different times after administration is summarized:D3,scattered dot;D17,D18,andD28,localized dot.(B)The morphology of staining in the left eye at different times after administration is summarized:D9,single dot;D10,D12,D20,and D30,localized dot;D24,large fusion.图1观察期间实验兔的左右眼角膜上皮着染出现的时间和形态汇总Figure 1 Summary of the timing and morphology of corneal epithelial staining in the left and right eyes of rabbits during theobservationperiod.AD24SD30CBD注：A，左眼角膜正常；B，右眼角膜正常；C，左眼视网膜正常；D，右眼视网膜正常；E，左眼哈氏腺正常；F，右眼哈氏腺正常。各图中比例尺大小为10 0 m。左右眼每个组织标本样本数各为2 0。Note:(A)Normal cornea in the left eye;(B)Normal cornea in the right eye;(C)Normal retina in the left eye;(D)Normal retina in the righteye;(E)Normal Hasselblad gland in the left eye;(F)Normal Hasselblad gland in the right eye.The scale size of each figure is 100 m.Atotal of 20 tissue samples were collected from each eye.图2 实验兔免染色检查31d后眼球及哈氏腺组织病理学观察（HE染色，2 0)Figure 2 The histopathology of the eyeballs and Harderian glands were observed after 30 days of staining(HEstaining,*20)312确实是药物产生刺激导致眼角膜损伤，那么在连续给药的情况下，着染出现的时间应有一定规律，即随给药时间的延长发生率升高，着染程度加重，且发生率和程度至少应高于阴性对照组。分析本研究中阴性对照组实验兔出现角膜上皮着染的原因，结合以往的文献资料，推测角膜上皮着染是由泪膜不稳定导致，而破坏泪膜稳态的因素分为内源性和外源性：内源性因素包括眼表组织的破坏及机体内环境的异常；外源性因素则是外源的刺激和破坏，例如佩戴角膜接触镜等【14-15。综上，考虑本研究的眼角膜着染现象主要为外源性的刺激引起，初步推测该刺激与实验者的操作有关。为了避免人为操作对试验结果评价的影响，结合本试验结果，笔者建议采用以下措施优化试验方法和评分标准，从而提高试验结果的准确性。（1）减少检查频率，如2 8 d的长时间给药周期可减少到37 d检查1次，从而降低人为操作所致的着染发生率，该措施可通过泪膜破裂时间的测定进一步证实其科学性16 。（2）建立实验室背景数据，增加着染项目的评分，并结合着染形态/程度和发生率制定评分标准，如本试验可将着染形态单点状着染、散在点状着染、局限性着染和大片融合着染分别评为1、2、3、4分，每天评分，最后计算总积分，当给药组的着染现象有规律变化且发生率高于阴性对照（3%）、总积分明显高于阴性对照组时，可初步判断为有刺激性。（3）结合组织病理学检查结果进行综合评价，当根据着染评分和发生率判断给药组有刺激性时，若组织病理学检查结果显示有刺激性，则最终判断有刺激性，否则需结合其他观察内容或增加其他观察指标来判断刺激性情况。医学伦理声明MedicalEthicsStatement本研究所涉及的所有动物试验均已通过云南省药物研究所实验动物管理与使用委员会（IACUC)审查批准审批号：动（伦）IACUC-2022-0011-01。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。All animal experiments involved in this study have beenreviewed and approved by the Experimental Animal EthicsCommittee of Yunnan Institute of Materia Medica(Approval Letter No.1ACUC-2022-0011-01).All experimentalprocedures were performed following the requirements ofChinas laws and regulations related to experimentalanimals,such as Animal Management Regulations(01/03/2017).实验动物与比较医学Laboratory Animal andComparativeMedicineissn.1671.7856.2012.001.017.AO H Y,CHENG S J,PAN F,et al.Standardization andprospect of alternative methods to cosmetics eye irritationJ.Chin J Comp Med,2012,22(1):74-77.DOl:10.3969/j.issn.1671.7856.2012.001.017.5 忻佳裕，纪宏宇，唐景玲，等.眼用制剂刺激性体内评价方法研究进展J.中国药师,2 0 15,18(4):6 44-6 46.DOl:10.3969/j.issn.1008-049X.2015.04.042.XIN J Y,JI H Y,TANG J L,et al.Study progress in eye irritationtest in vivo for ophthalmic preparationsJJ.China Pharm,2015,18(4):644-646.DOl:10.3969/j.issn.1008-049X.2015.04.042.6 肖云峰,盛惟,刘剑.0.0 1%硫酸阿托品滴眼液对实验动物眼部的安全性评价研究J.北方药学，2 0 2 0,17(7):143-144,196.DOI:10.3969/j.issn.1672-8351.2020.07.107.XIAO Y F,SHENG W,LIU J.Safety evaluation of 0.01%atropine sulfate eye drops on the eyes of experimentalanimalsJ.J North Pharm,2020,17(7):143-144,196.DOl:10.3969/j.issn.1672-8351.2020.07.107.Jun.2023,43(3)作者贡献AuthorContribution徐红花负责课题设计、过程管理、数据统计分析、论文写作、修改和定稿；金天、王海、沈梦莹、王瑞、周艺佳参与试验操作、数据收集，稿件修改过程的审核；谭莹负责试验人员、实验动物、仪器设备的统筹协调，以及论文审核。利益声明DeclarationofInterest所有作者均声明本文不存在利益冲突。参考文献References1石莹,阮鸿洁,张宏伟,等.化妆品及原料眼刺激性STE法评价J.中国公共卫生，2 0 2 0，36(5)：7 45-7 48.DOI:10.11847/zgggws1123082.SHI Y,RUAN H J,ZHANG H W,et al.Assessment on eyeirritation of cosmetics raw materials and products with shorttime exposure in vitro testJ.Chin J Public Health,2020,36(5):745-748.DOl:10.11847/zgggws1123082.2王庆利,彭健.Draize眼刺激性试验的评价J.中药新药与临床药理,2 0 0 5,16(4):30 1-30 4.DOl:10.19378/j.issn.1003-9783.2005.04.026.WANG Q L,PENG J.Evaluation of Draize eye irritation testJ.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol,2005,16(4):301-304.DOl:10.19378/j.issn.1003-9783.2005.04.026.3 钱仪敏，王若男，李华，等.眼刺激性评价体外替代方法研究进展J.中国新药杂志，2 0 2 0,2 9(6):6 18-6 2 3.DOl:10.3969/j.issn.1003-3734.2020.06.005.QIAN Y M,WANG R N,LI H,et al.Research progress on invitro alternative method 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