吸入气管内雾化脂多糖致急性肺损伤小鼠肺组织转录组分析.pdf

吸入气管内雾化脂多糖致急性肺损伤小鼠肺组织转录组分析王佳新1,2,3，徐耀迪2,3，郑鑫2,3，陈旭昕2，张春阳2，王凡2，丁毅伟2，肖漓3，韩志海1,21解放军总医院研究生院，北京100853；2解放军总医院第六医学中心呼吸与危重症医学科，北京100048；3解放军总医院第八医学中心呼吸与危重医学部研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室，北京100091摘要：背景急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)是危重症医学和基础医学研究重要的关注焦点。明确 ALI 时关键损伤机制及差异性基因的变化，对探究 ALI 的发生发展至关重要。目的研究气管内雾化脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)致 ALI 小鼠肺组织的转录组基因谱变化，探索 ALI 潜在损伤机制及治疗靶点。方法36 只小鼠随机分为对照组和气管内雾化 LPS 组(时间分为致伤后 6h、12h、24h，每组各 9 只)。实验组给予气管内雾化 50L的 LPS15mg/kg，对照组给予气管内雾化等体积 0.9氯化钠注射液。比较组间组织病理学、病理损伤评分及肺系数变化，检测肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)及血清中肿瘤坏死因子-(tumornecrosisfactor-，TNF-)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)等水平。肺组织行转录组测序，寻找差异基因，并对上调、下调基因分别进行 GO 和 KEGG 富集分析，对持续性改变的差异基因进行 GO 功能富集整合及共表达网络分析。结果与对照组相比，吸入气管内雾化 LPS 后小鼠肺组织炎症细胞浸润、水肿加重伴出血，肺损伤评分及肺系数评分逐渐增高，24h 时损伤最严重；TNF-、IL-6、MCP-1 的表达均显著升高(P0.01)，BALF 与血浆中表达存在一定差异；转录组学提示 12h 组上调基因 1545 个、下调基因 1670 个，24h 组上调基因 1312 个、下调基因 1139 个。KEGG 富集分析显示差异基因涉及炎症反应、遗传信息调控、信号转导等通路，GO 富集分析显示差异基因集中在细胞因子生成及免疫反应调控、白细胞的免疫介导及免疫调节、白细胞迁移(上调基因)，以及血液循环、信号传导、神经突触、肌肉收缩等(下调基因)。PPI 分析提示持续性上调的关键基因包括 Tnf、IL-1、Ifn-、Ccl2、Ccl5、Nod2、Tlr2、Lgals9。而持续性下调的关键基因包括 Cav1、Sulf1、Sox4、Tgf、Apoe、Tek。结论气管内雾化 LPS12h 建立稳定、可靠的小鼠急性肺损伤模型。Tnf、IL-1、Ifn-、Ccl2、Ccl5、Nod2、Tlr2、Lgals9 等关键基因可能是 ALI 中免疫与炎症反应中的关键调节因子和靶基因。关键词：急性肺损伤；转录组；气管内雾化；差异性基因；小鼠动物模型中图分类号：R563.8文献标志码：A文章编号：2095-5227(2023)06-0668-10DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2023.06.016引用本文：王佳新，徐耀迪，郑鑫，等.吸入气管内雾化脂多糖致急性肺损伤小鼠肺组织转录组分析J.解放军医学院学报，2023，44（6）：668-677.Transcriptome analysis of lung tissue in mice with intratracheal aerosolized lipopolysaccharide-induced acute lung injuryWANG Jiaxin1,2,3,XU Yaodi2,3,ZHENG Xin2,3,CHEN Xuxin2,ZHANG Chunyang2,WANG Fan2,DING Yiwei2,XIAO Li3,HANZhihai1,21GraduateSchool,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;2DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,theSixthMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100048,China;3InstituteofRespiratoryandCriticalMedicine,theEighthMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,BeijingKeyLaboratoryofOTIR,Beijing100091,ChinaCorrespondingauthors:XIAOLi.Email:;HANZhihai.Email:Abstract:BackgroundAcutelunginjury(ALI)/acuterespiratorydistresssyndrome(ARDS)isanimportantfocusofresearchincriticalcaremedicineandbasicmedicalscience.ClarificationofthekeydamagemechanismsanddifferentialgenechangesinALIisessentialtocontrolthedevelopmentofALIandexploreeffectivetreatments.ObjectiveToinvestigatethetranscriptionalprofileoflunghistologyandlungtissueatdifferenttimepointsinmicemodelofintratrachealaerosolizedlipopolysaccharides(LPS)-induced ALI,and explore the potential mechanisms of injury and therapeutic targets of ALI.Methods Thirty-six mice wererandomlyassignedtothecontrolgroupandtheintratrachealnebulizedLPSgroups(6h,12hand24hpost-injury,respectively;9收稿日期：2022-11-11基金项目：军队后勤科研项目(CLB20J019；BHJ16J011)作者简介：王佳新，女，硕士，医师。Email:通信作者：肖漓，女，博士，主任技师，教授。Email:；韩志海，男，博士，主任医师，教授。Email:668解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/miceineachgroup).Miceintheexperimentalgroupwereintratracheallynebulizedwith50LofLPS15mg/kg,andthecontrolgroupwereintratracheallynebulizedwithanequalvolumeof0.9%sodiumchloride.Thehistological,pathologicalinjuryandlungcoefficientchangeswerecomparedamongthegroups,andthelevelsofTNF-,IL-6andMCP-1inalveolarlavagefluidandserumweredetected.Lungtissuetranscriptomesequencingwasperformedineachgroupofmicetosearchfordifferentialgenes,andGOandKEGGenrichmentanalyseswereperformedforup-anddown-regulatedgenes.ThenGOfunctionalenrichmentintegrationandco-expressionnetworkanalyseswereperformedfordifferentialgeneswithpersistentalterations.ResultsComparedwiththecontrolgroup,lunghistologyintheLPSgroupshowedincreasedinflammatorycellinfiltration,andpulmonaryvascularedemawithasmallamountofhemorrhage.Thelunginjuryscoreandlungcoefficientscoregraduallyincreasedandappearedthemostseriousinjuryat24h.TheexpressionlevelsofTNF-,IL-6,andMCP-1increasedsignificantly,andtherewasacertaindifferencebetweentheexpressioninBALFandplasma(P1.5，RNA 完整性数(RIN)7 被用作高质量 RNA 的标准。质检合格后，使用连接有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物 mRNA，随后在NEBFragmentationBuffer 中用二价阳离子将得到的 mRNA 随机打断，按照 NEB 普通建库方式进行建库。构建的文库应用 Qubit2.0Fluorometer 进行初步定量，Agilent4200 检测文库的大小。文库质检合格后用 IlluminaNovaseq 平台对单个文库进行配对端测序。9肺组织转录组测序数据质控和表达量分析应用 Trimmomatic(http:/www.usadellab.org/cms/index.phppage=trimmomatic)对原始测序数据进行修剪和质控，通过质检后，利用高通量测序比对工具HISAT2(http:/daehwankimlab.github.io/hisat2)将测序结果与小鼠参考基因组(mm10)进行比对。根据比对结果使用htseq-count(http:/htseq.readthedocs.io/en/master/count.html)工具计算基因表达水平。10表达差异分析及GO和KEGG富集分析利用 R 包 DEGreport(http:/bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)获得组间差异表达结果。以 P0.05 且|log2FoldChange|1 作为筛选标准，得到差异表达基因(DEGs)(http:/www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEGreport.html)，识别在三个组别中的 DEGs 并基因表达水平的箱线图。利用 R 包 clusterProfiler(http:/www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)，以 P0.05 为标准，将 DEGs 富集到不同 GO 通路(生物过程、细胞组分、分子功能)及 KEGG 通路，并可视化。结果1气管内雾化吸入 LPS 致 ALI 模型肺组织病理变化情况HE 染色显示，与对照组相比，气管内雾化 LPS6h时小鼠肺泡壁轻度增厚，少量中性粒细胞浸润，肺血管内可见炎性细胞。12h 时肺损伤进一步加重，可见大面积肺泡壁增厚，肺泡内较多炎细胞浸润伴少量红细胞。肺血管周围见中性粒细胞和淋巴细胞浸润，管腔内多见炎性细胞。24h 时损伤最重，肺泡壁显著增厚，肺泡腔内充满以中性粒细胞为主的炎性细胞及少量红细胞；血管周围明显水肿伴少量出血，管腔内大量图 1 雾化吸入 LPS 不同时间组小鼠肺组织病理改变(200)A：对照组；B：6 h 组；C：12 h 组；D：24 h 组Fig.1 Histopathological changes in the lungs of mice in different time groups of aerosolized LPS inhalation(200)A:control;B:LPS 6 h;C:LPS 12 h;D:LPS 24 h670解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/炎细胞浸润(图 1)。2病理损伤评分及肺系数比较比较结果如表 1所示。LPS 刺激后 6h、12h、24h，肺损伤评分显著高于对照组(P0.01)。LPS 刺激后 12h、24h肺系数显著高于对照组，其中 24h 肺系数最高(P0.05)。结果表明，随着气管内雾化 LPS 刺激时间的延长，肺组织损伤逐渐加重，出现明显的炎症浸润、肺水肿等急性肺损伤表现。3BALF 中总蛋白含量及白细胞计数比较结果如表 2 所示。(1)BALF 中总蛋白浓度水平数据：与对照组相比，从 LPS 刺激后 6h 开始升高，12h升高显著(P0.01)，24h 达到最高值(P0.01)。(2)BALF 中白细胞计数：与对照组相比，LPS 刺激后 12h(P0.01)、24h 白细胞数目显著增多(P0.01)，而 LPS 刺激后 6hBALF 中总蛋白含量和白细胞计数变化无差异。提示吸入气管内雾化LPS 后肺部血气屏障破坏，12h 开始肺血管通透性变化更明显，肺泡腔内炎症细胞逐渐聚集，进一步表明吸入气管内雾化 LPS12h 时建立的 ALI模型更稳定。4BALF 与血清中炎症因子 TNF-、IL-6、MCP-1含量在 BALF 中，TNF-持续升高，与对照组相比，在 24h 变化最显著(P0.01)；IL-6在 LPS刺激后 6h 相较于 12h、24h 变化最显著(P0.01)；MCP-1 在 6h、12h 持续升高，在 12h 表达最显著(P0.01)(图 2A、图 2B、图 2C)。在血清中，与对照相比，TNF-、IL-6 在 LPS刺激早期 6h 表达最高，随后逐渐下降；而 MCP-1 随时间增加，表达逐渐增高，在 24h 最显著(P0.01)(图 2D、图 2E、图 2F)。以上结果提示，吸入气管内雾化表 1 不同时间组病理损伤评分及肺系数比较Tab.1 Comparison of pathological injury scores and lung coefficients in different time groups指标对照组(n=9)LPS6h(n=9)LPS12h(n=9)LPS24h(n=9)F值P值病理损伤评分0.830.752.680.52a5.170.75ab8.810.75abc146.3870.001肺系数0.600.030.620.040.740.05ab0.990.03abc119.9650.001aP0.05，vs对照组；bP0.05，vsLPS6h；cP0.05，vsLPS12h。表 2 BALF 中总蛋白含量及白细胞计数Tab.2 Total protein content and white blood cell count in BALF指标对照组(n=9)LPS6h(n=9)LPS12h(n=9)LPS24h(n=9)F值P值总蛋白浓度(mgmL-1)0.460.030.730.121.0270.20ab1.490.20abc92.5100.001白细胞总数/(L-1，10)0.830.131.230.402.770.76ab3.500.20abc127.6730.001aP0.05，vs对照组；bP0.05，vsLPS6h；cP0.05，vsLPS12h。图 2 吸入气管内雾化 LPS 不同时间组小鼠 BALF 和血清中 TNF-、IL-6、MCP-1 浓度Fig.2 TNF-,IL-6,MCP-1 levels in BALF and serum of mice in different time groups of aerosol LPS解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/671LPS 能够引起的肺部剧烈的炎症反应，以更好地模拟 ALI 时肺组织局部的病理生理变化，吸入气管内雾化 LPS 致 ALI 小鼠模型成功建立。5测序结果和 DEGs 筛选对照组、LPS12h组、LPS24h 组急性肺损伤小鼠肺组织进行 ployA转录组测序(n=3)。结果显示，与对照组肺组织转录组比较，LPS12h 组有 1545 个基因表达上调，有 1670 个基因表达下调。LPS24h 组有 1312 个基因表达上调，有 1139 个基因表达下调(图 3)。6不同时间点 DEGs 的 GO 富集分析及 KEGG通路富集分析LPS12hDEGs 的 GO 富集提示，上调基因的生物过程和分子功能主要集中在诱导炎细胞黏附与迁移、激活并调控炎症因子及免疫细胞等。而下调基因集中在 Wnt 信号、跨膜转运蛋白与离子通道活性等。KEGG 提示上调基因在激活炎症与免疫系统(TNF、NF-B 等)、感染(EB病毒、COVID-19 等)相关信号通路大量富集，而下调基因涉及调控肺损伤后修复的信号通路，如Wnt、Ras相关蛋白 1(Rap1)等(图 4A、图 4B)。LPS24h 组 GO 富集提示上调基因中参与诱导炎细胞及免疫反应等基因数量显著增多，而下调基因参与调控循环过程、第二信使介导的信号等生物过程和分子功能。KEGG提示上调基因富集大量自噬相关信号通路，而下调基因在脂肪细胞因子(Apelin)信号通路、黏着斑等调节血管平滑肌功能相关通路更显著(图 4C、图 4D)。7LPS 刺激后持续性上调和下调基因 GO 功能富集整合分析结果提示，LPS 刺激 12h、24h后，差异性基因变化基本相同。其中，持续性上调的基因主要集中在细胞因子生成的正调控、免疫反应的调控、白细胞介导免疫、调节免疫效应过程和白细胞迁移；持续性下调的基因主要集中在血液循环、第二信使介导的信号传导、Wnt 信号的调控及神经突触、肌肉收缩的改变。这提示气管内雾化 LPS 能够有效地诱导出相对稳定的ALI 模型(图 5)。8持续上调、下调 DEGs 共表达网络分析(PPI)结果如图 6 所示，持续性上调的关键基因包括Tnf、IL-1、Ifn-、Ccl2、Ccl5、Nod2、Tlr2、Lgals9；持续性下调的关键基因包括 Cav1、Sulf1、Sox4、Tgf、Apoe、Tek。讨论与气管滴注、腹腔注射等给药途径相比，吸入雾化 LPS 产生的肺损伤更均匀，能够提高LPS 吸收率并诱导早期炎症反应的发生，操作对动物无明显刺激5-6。本研究优化雾化给药方式，用定量雾化针直接将 LPS 递送到气管内，建立小鼠 ALI 模型。结果显示，与对照组相比，雾化LPS 组随着时间的增加小鼠肺组织均发生了明显的病理改变，肺损伤评分及肺系数增高、BALF 总蛋白含量、白细胞计数升高、BALF 和血浆中的TNF-、IL-6 和 MCP-1 表达显著增加。本研究还发现不同的细胞因子在外周血和 BALF 中的表达含量在时间上存在一定差异，BALF 中 TNF-、MCP-1 表达含量随时间增加显著高于外周血。这表明气管内雾化 LPS 能够引起的肺部剧烈的炎症反应，更好地模拟 ALI 时肺组织局部的病理生理变化，且吸入气管内雾化 LPS12h 时 ALI 模型更稳定。图 3 12 h(A)与 24 h(B)LPS 诱导的 ALI 小鼠差异基因转录组表达的影响Fig.3 Effect of DEGs transcriptome expression in LPS-induced ALI mice at 12 h(A)and 24 h(B)672解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/既往研究资料显示，ALI/ARDS 异质性较强，这可能与不同阶段肺组织中基因表达水平差异相关。因此本研究对雾化 LPS12h、24h 诱导的 ALI 小鼠的肺组织转录组测序，动态评估DGEs 变化趋势，探究 ALI发病机制的关键基因和信号通路。结果显示，LPS12h、24h 的差异基因 GO 富集分析结果及趋势基本相同。对持续性上调的基因进行 GO 整合分析，提示主要参与促进细胞因子生成、调控炎症与免疫反应、调节免疫效应过程和诱导白细胞迁移，且随时间的延长解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/673图 4 不同时间点 DEGs 的 GO 富集分析及 KEGG 通路富集分析A：LPS 12 h 上调基因；B：LPS 12 h 下调基因；C：LPS 24 h 上调基因；D：LPS 24 h 下调基因Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs and KEGG pathway enrichment analysis at different time pointsA:LPS 12 h up-regulated DEGs;B:LPS 12 h down-regulated DEGs;C:LPS 24 h up-regulated DEGs;D:LPS 24 h down-regulatedDEGs674解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/富集在这些功能上的基因数量显著增多。KEGG提示主要参与炎症与免疫系统相关信号通路的激活(TNF、IL-17、NF-B、Toll 样受体等)。值得注意的是，持续性上调基因 PPI 分析显示，细 胞 因 子(TNF-、IL-1、IFN-、CCL2、CCL5)、模式识别受体(NOD2、TLR2、LGALS9)可能是 ALI 时调节炎症与免疫反应的关键基因。目前已有大量研究揭示了肺部先天免疫系统的启动加速 ALI 的进程7-8。TNF-、CCL2(编码MCP-1)、CCL5、IFN-、IL-1 是所有调控 ALI 时肺部发生先天免疫反应变化的关键桥梁，通过连接其他细胞因子及活化免疫细胞而发挥作用。一些来自临床 ALI 患者转录组数据也支持了同样的观点9-10。有研究表明用 TNF-和 IFN-的中和抗体治疗可以保护小鼠免受 2019-nCoV 感染、败血症、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和细胞因子休克期间的死亡11。ALI 时模式识别受体的变化在启动先天免疫系统中至关重要。研究显示，脓毒症患者的 TRL2、NOD2 均高表达参与诱导细胞因子风暴，促进免疫炎症反应12。值得注意的是，LGALS9(编码人半乳糖凝集素-9)在各种肿瘤中表达广泛，是肿瘤细胞重要的免疫检查点。最新一项针对肺部慢性疾病人群的肺组织转录组分析发现，LGALS9 可能是治疗 COPD 有效的生物学标志物13。而其在急性肺损伤中的作用特点尚未见报道，提示可能是新的免疫靶点方向。ALI 发生往往涉及多个信号的级联反应，然而每个靶基因的作用位置和有效时间可能相互重叠，联合多个靶点共同治疗相比单一靶点治疗可能产生更有效的治疗作用。持续性下调的基因进行 GO 整合分析，提示主要与血液循环、第二信使介导的信号传导、Wnt 信号的调控及神经突触、肌肉收缩相关。KEGG 提示 Wnt 信号通路表达最显著。雾化 LPS24h 时调节血管平滑肌功能相关通路富集基因数量变化最明显。进一步 PPI 分析表明，Wnt 信号的转录调节因子(Cav1、Sulf1、Sox4)、调节内皮与上皮细胞完整性的基因(Tgf、Apoe、Tek)可能是ALI 时下调的关键作用基因。已有多项研究表明Wnt 信号在 ALI 早期大量激活，参与协调损伤后的肺修复。一方面，肺泡上皮细中的 Wnt 信号激活肺成纤维细胞，减轻炎症反应，促进早期肺组织修复纤维化14-15；另一方面，也可以作为受损上皮再生信号，诱导内源性多能干细胞向肺上皮细胞和内皮细胞分化，完成受损肺组织的自我更新修复16。这提示了调控 Wnt 信号通路可能是ALI 早期救治的有效手段。有趣的是，Cav1/Sulf1/Sox4 均可以通过 Wnt 信号通路参与肺部肿瘤的发生发展17-19。而其本身以及与 Wnt 信号通路在肺损伤中的关系仍未明确。已有研究表明 COVID-19患者的肺组织中 Apoe 表达修饰变异且表达量显著降低，不仅促进脂代谢紊乱，同时增加血管内皮的通透性以及炎症反应，提示患者预后不良。应用 Apoe 模拟肽显著减轻小鼠 ALI 模型肺损伤的严图 5 持续性上调、下调的基因进行 GO 功能富集整合分析A：持续性上调基因；B：持续性下调基因Fig.5 GO functional enrichment integration analysis of persistently up and down-regulated genesA:persistent up-regulated DEGs;B:persistent down-regulated DEGs解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/675图 6 持续上调、下调 DEGs PPI 分析A：持续性上调差异基因；B：持续性下调差异基因Fig.6 PPI network analysis of continuously up-regulated and down-regulated DEGsA:persistent up-regulated DEGs;B:persistent down-regulated DEGs676解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/重程度20-21。未来吸入 Apoe 模拟肽可能成为临床治疗 ALI治疗的新靶点。同时，我们也关注到TGF-、Tek 在下调基因显著表达，其在调控肺血管内皮和肺泡上皮完整性等肺损伤修复方面起到关键作用。综上，本研究利用气管内雾化 LPS诱导的ALI 模型稳定可靠，能够高效激发肺组织各种炎症及免疫风暴，有利于筛选不同时间点差异性基因。持续性上调基因中细胞因子(TNF-、IL-1、IFN-、CCL2、CCL5)、模式识别受体(NOD2、TLR2、LGALS9)可能是 ALI 时调节免疫与炎症反应的关键因子和靶基因，发挥救治作用重要靶点。值得注意的是，虽然我们的动物 ALI 模型对找出不同时间节点的关键作用基因，探索 ALI 发生发展机制有一定的参考价值，但临床中 ALI 的发生发展并非是单一因素作用结果。因此在筛选目标靶基因探究治疗作用时，也应考虑其对全身炎症反应的作用以及其他组织器官的影响。作者贡献作者贡献王佳新：动物实验，实验指标检测，实验数据分析处理，论文撰写；徐耀迪：动物实验，实验指标检测；郑鑫、陈旭昕、张春阳、王凡、丁毅伟：实验设计与指导；肖漓、韩志海：文章校对及修改。利益冲突利益冲突所有作者声明无利益冲突。数据共享声明数据共享声明本篇论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：。参考文献Yadav H，Thompson BT，Gajic O.Fifty years of research inARDS.is acute respiratory distress syndrome a preventabledisease?J.Am J Respir Crit Care Med，2017，195（6）：725-736.1Ranieri VM，Rubenfeld G，Slutsky AS.Rethinking ARDSAfterCOVID-19.IfaBetterDefinitionIstheAnswer，WhatIsthe 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