荧光光度法测定样品中维生素B2的含量.doc

实验六 荧光光度法测定样品中维生素B2的含量

一、目的与要求
1． 掌握用荧光光度法测定维生素B2的原理;
2． 加深对荧光光度法原理的理解;
3． 巩固荧光光度计的基本操作。
二、方法原理
维生素B2又称核黄素，溶于水，在ω为0.05的乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。维生素B2在一定波长光照射下产生荧光。在稀溶液中，其荧光强度与浓度成正比，即：
F = Kc
故可采用标准曲线法测定维生素B2的含量。
三、仪器与试剂
1．930型荧光光度计及其附件。
2．容量瓶：25 mL。
3．维生素B2标准贮备液（100 mg·L-1）：准确称取25mg维生素B2，用ω为0.05的乙酸溶解，转移至250 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，保存于冰箱中。
4．维生素B2标准工作液（0.5mg·L-l）：吸取上述贮备液0.50mL于100 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，随用随配。
5．含维生素B2的水样（自行制备）：取VB2片剂一片，用ω为0.05的乙酸溶液溶解（若有不溶杂质，过滤即可），稀释适当倍数后测量。
四、内容与步骤
1．标准系列溶液的配制
吸取维生素B2标准工作液0，0.50，1.00，2.00，3.00和4.00 mL，分别加入6个25 mL容量瓶中用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀。
2．样品的准备
吸取含维生素B2的水样5.00 mL于25 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀。
3．标准系列与样品溶液的测定
按仪器的使用方法准备好仪器(仪器操作流程如下)。待仪器稳定后，以360 nm或400 nm为激发波长，以550 nm为荧光发射波长，用1 cm荧光皿及ω为0.05的乙酸溶液作参比（凋荧光强度为“0”），用标准系列溶液中最高浓度的溶液调节其荧光强度为“100”，分别测定其他标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。
仪器操作流程如下：
标准系列溶液的测定：

双击FL Winlab
Application
Concentration
References
输入浓度单位（concentration units）
clear
选择添加（add）或消除（remove）样品号
依次输入相应浓度值
测量背景（measure background）
鼠标放在相应样品号上，按measure 测量

测样：
单击samples
添加(add)或消除(remove)试样号
放入背景，点击background
按绿灯
在对话框中点击“是”
点击measure

五、数据记录与处理
1．列表记录各项实验数据。
2．以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3．根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的浓度Cx，，依下式计算水样中维生素B2的含量：
水中维生素B2含量（rng·L-l）＝Cx×稀释倍数
六、问题与讨论
1．激发波长与荧光波长有何关系？为什么？
2．测定过程中应注意哪些问题？