上海主养区凡纳滨对虾8种流行病病原监测及分析.pdf

doi:10.16446/j.fsti.20230400112 收稿日期:2023-04-12 作者简介:张小明(1990),男,助理工程师,研究方向为水生生物疫病防控。E-mail:xmzhangwork 通信作者:张明辉(1978),男,高级工程师,研究方向为水生生物疫病防控。E-mail:mhzhang0907 项目资助:上海市现代农业产业技术体系沪农科产字(2022)第 5 号。上海主养区凡纳滨对虾 8 种流行病病原监测及分析 张小明 安伟 张明辉(上海市水产研究所,上海市水产技术推广站,上海 200433)摘 要:为进一步掌握上海地区养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原的流行趋势及特点,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开展了 8 种流行病病原监测及分析工作。51 份样品的分子检测和细菌分离鉴定结果显示,有 4 种病原检测出阳性,其中虹彩病毒 1(DIV1)阳性检出率为 29.41%,传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)为 3.92%,致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)为 1.96%,副溶血弧菌(Vp)为19.61%;而白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等 4 种病原未检出。408 项病原检测结果中,4 种病原的阳性总样本数量为 28 份,总体阳性率为6.86%。结果表明,上海地区养殖凡纳滨对虾的病原携带率处于较低水平,DIV1、副溶血弧菌(Vp)是携带的主要病原。在实际生产中应根据病原流行特点,从苗种选购、养殖过程管理、药物选用等方面进行综合防控,减少病害发生。关键词:凡纳滨对虾;十足目虹彩病毒 1(DIV1);致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND);副溶血弧菌(Vp);传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV);虾肝肠胞虫(EHP)凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,原产于南美洲太平洋沿岸,因其营养丰富、肉味鲜美、适应盐度范围广等优点,目前已成为我国重要的水产养殖品种1。但近年来,在凡纳滨对虾养殖过程中常常暴发流行性疾病,如急性肝胰腺坏死病1、虾虹彩病毒病2、白斑综合征3、桃拉综合征4、传染性皮下及造血组织坏死病5、偷死野田村病6和虾肝肠胞虫病7等,导致养殖产量严重下滑,对对虾养殖业发展构成了严重威胁。虾虹彩病毒病是一种感染甲壳类的急性、传染性疾病,病原为十足目虹彩病毒 1(DIV1),简称虹彩病毒,患病的凡纳滨对虾表现为空肠空胃、肝胰腺萎缩、颜色变浅、停止摄食、活力下降等症状。DIV1 病毒 2014 年首次在浙江某养殖场的凡纳滨对虾中被发现,近年来,已陆续在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、红 螯 螯 虾(Cherax quadricarinatus)等虾类体内被发现,其传播速度快,宿主范围广、致死率高,给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失8。传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地的养殖对虾,感染凡纳滨对虾后会引起慢性“矮小残综合症”,患病对虾生长缓慢,畸形,受感染的对虾终生携带病毒,并进行垂直和水平传播9。弧菌属于条件性致病菌,在条件适宜的情况下,弧菌病具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点。安伟等10的研究结果显示,上海凡纳滨对虾主养区以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)诱发的疾病为主,其中以急性肝胰腺坏死病(AHPND)的危害最为严重。该病的病原菌主要是携带5322023,50(4)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)pirAvp和 pirBvp基 因 的 变 种 副 溶 血 弧 菌(VpAHPND),患病的对虾摄食减少,空肠空胃,肝胰腺萎缩、发白,虾壳松软,死亡率高达 90%以上1。弧菌病已给多国对虾养殖业带来了巨大的经济损失。普通副溶血弧菌(Vp)虽然没有变种弧菌引起的危害严重,但仍能引起一些对虾发病,需加强病原监测。凡纳滨对虾是上海市水产养殖的主要品种,2022 年养殖面积约 2 738.87 hm2,主要集中在奉贤区、金山区等郊区11。近年来,水产养殖业因病害造成的经济损失以凡纳滨对虾养殖最为严重,病害问题是凡纳滨对虾养殖生产过程中的突出问题。因此,加强凡纳滨对虾养殖生产的流行病病原监测,及时、准确地掌握和诊断病原携带情况,尽快采取有效应对措施是保证对虾健康和生态养殖的关键。为掌握上海地区养殖凡纳滨对虾主要流行病病原的携带情况,本研究于 2022 年 3月2023 年 3 月,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开 展 Vp、Vp AHPND、DIV1、白 斑 综 合 征 病 毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、IHHNV、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等 8 种病原的监测及分析,以期为上海地区虾病防控、健康养殖提供参考,为制定科学合理的防控对策提供依据。1 材料和方法1.1 主要试剂TaKaRa miniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(9766)提取试剂盒、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)、PCR Premix Taq、DNA Marker 均购自宝生生物工程(大连)有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)、3%碱性蛋白胨水均购自北京陆桥技术有限公司。1.2 样品采集2022 年 3 月2023 年 3 月,定期采集上海郊区的3 个凡纳滨对虾主养区(A、B、C)的5 个养殖场(a、b、c、d、e)养殖的凡纳滨对虾,从放苗到养殖过程中持续采样,共采集 51 份样品,其中 A 区16 份,B 区 31 份,C 区 4 份。按照世界动物卫生组织(OIE)规定的抽样比例12,随机抽取一定数量的凡纳滨对虾样品,每批次样品不少于 150 尾。一部分样品用 95%乙醇固定保存,用于后续的分子检测;一部分活体样品则运至实验室用于弧菌的分离鉴定。1.3 副溶血弧菌(Vp)的分离、鉴定及保存采用平板分离方法:无菌剖取肝胰脏,取 1 g组织混样置于 10 mL 的 3%碱性蛋白胨水中,30 培养 18 h 后,分别在 TCBS 培养板上划线培养,1824 h 后观察菌落特征。挑取具有典型弧菌特征的单菌落,接种到TSA 培养平板上划线培养 1824 h,用无菌接种环挑取单菌落,接种到 3 mL 灭菌的 0.45%生理盐水,最终配成菌液浓度在 0.50 0.64 麦氏度后,再用 VITEK2 Compact 全自动细菌鉴定仪进行分析鉴定。将已鉴定的副溶血弧菌(Vp)单菌落再次纯化,接种到 3%碱性蛋白胨水中增菌培养 18 24 h,用甘油(最终体积分数为 20%)于-80 保存备用。1.4 病原的分子检测1.4.1 核酸提取取 50 mg 虾组织匀浆液,参照 RNA/DNA 提取试剂盒说明书的方法进行核酸提取,于-80 保存备用。1.4.2 PCR 检测以提取的 DNA 或 RNA 为模板,分别进行PCR 检测。DIV1、WSSV、IHHNV、EHP 和 VpAHPND的 PCR 反应体系为 25.0 L:Premix Taq 12.5 L,上、下游引物各 1.0 L,DNA 模板 2.0 L,无菌 ddH2O 8.5 L,设置 ddH2O 为阴性对照模板。套式 PCR 以第一轮 PCR 产物为模板加 1.0 L。TSV 和 CMNV 的 PCR 反应体系为 25.0 L:2 1 Step Buffer 12.5 L,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 L,上、下游引物各1.0 L,RNA 模板 2.0 L,无菌 ddH2O 7.5 L。套式 PCR 反应体系:Premix Taq 12.5 L,上、下游引物各 1.0 L,第一轮 PCR 产物模板 1.0 L,无菌 ddH2O 8.5 L。检测 7 种病原的引物和方法具体见表1,文献中的引物与国标引物相同。反应结束后,取 6 L 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,并在凝胶成像系统拍照。PCR 阳性扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。632水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(4)表 1 7 种凡纳滨对虾病原名称和引物病原名称引物名称引物序列(53)产物长度/bp参考文献十足目虹彩病毒 1(DIV1)DIV1-F1GGGCGGGAGATGGTGTTAGATDIV1-R1TCGTTTCGGTACGAAGATGTADIV1-F2CGGGAAACGATTCGTATTGGGDIV1-R2TTGCTTGATCGGCATCCTTGA4571292白斑综合征病毒(WSSV)WSSV-F1ACTACTAACTTCAGCCTATCTAGWSSV-R1TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGAWSSV-F2GTAACTGCCCCTTCCATCTCCAWSSV-R2TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT1 4479413桃拉综合征病毒(TSV)TSV-FAAGTAGACAGCCGCGCTTTSV-RTCAATGAGAGCTTGGTCC2314传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)IHHNV-FCGGAACACAACCCGACTTTAIHHNV-RGGCCAAGACCAAAATACGAA3899对虾偷死野田村病毒(CMNV)CMNV-F1AAATACGGCGATGACGCMNV-R1ACGAAGTGCCCACAGACCMNV-F2TCCCGTATTCGTGGATCMNV-R2TAGGGTCAAAAGGTGTAGT6194136虾肝肠胞虫(EHP)EHP-F1TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTEHP-R1CACGATGTGTCTTTGCAATTTTCEHP-F2TTGGCGGCACAATTCTCAAACAEHP-R2GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA5141477致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)AP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACAP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGGAP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTC1 26923012 结果与分析2.1 检测结果经 PCR 检测分析,2022 年 3 月2023 年 3月采集的 51 份凡纳滨对虾样品中,携带 DIV1 病毒的 15 份(见 图 1),携 带 VpAHPND的 1 份(见图 2),携带 IHHNV 的 2 份,阳性检出率分别为 29.41%、1.96%、3.92%。WSSV、TSV、CMNV、EHP 等 4 种病原未检出;经平板划线分离到副溶血弧菌(Vp)10 株,阳性检出率为 19.61%。注:M.DL 1 000 DNA Marker;113.检测样品;N.阴性对照;P.阳性对照。图 1 部分凡纳滨对虾样品 DIV1 的 PCR 扩增结果 注:M.DL 2 000 DNA Marker;110.检测样品;N.阴性对照;P.阳性对照。图 2 部分凡纳滨对虾样品 VpAHPND的 PCR 扩增结果 8 种流行病的 408 项病原检测结果显示,DIV1、IHHNV、VpAHPND 和 Vp 这 4 种病原的阳性总样本数量为 28 份,总体阳性率为 6.86%。其中DIV1 阳性率占比最高,为 29.41%,Vp 次之,为19.61%,VpAHPND和 IHHNV 阳性率较低,分别为1.96%和 3.92%;其余 4 种病原未检出(见表 2)。7322023,50(4)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)表 2 凡纳滨对虾病原检测结果统计序号检测病原名称样品数量/份阳性数量/份阳性率/%1白斑综合征病毒(WSSV)51002桃拉综合征病毒(TSV)51003传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)5123.924虾肝肠胞虫(EHP)51005虾虹彩病毒(DIV1)511529.416偷死野田村病毒(CMNV)51007致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)5111.968副溶血弧菌(Vp)511019.61合计408286.862.2 不同区域检测情况从 51 份凡纳滨对虾样品的病原携带情况分析,养殖场 a、b 主要携带 DIV1 和 Vp,养殖场 c 主要携带 DIV1 和 VpAHPND,养 殖 场 d 主 要 携 带DIV1,养殖场 e 携带 DIV1 和 IHHNV。5 个养殖场同时携带 DIV1,而仅在 1 个养殖场的 1 份样品中检测到 VpAHPND,另 1 个养殖场的 2 份样品中检测到 IHHNV(见图 3)。从 3 个主养区的病原携带情况分析,A 区主要携带 DIV1 和 Vp,B 区主要携带 DIV1、Vp 和 VpAHPND,C 区主要携带 DIV1 和IHHNV(见图 4)。3 个主养区域同时携带有DIV1。图 3 5 个养殖场 DIV1、Vp、VpAHPND和IHHNV 病原携带情况 图 4 3 个主养区域病原携带情况3 讨论随着集约化养殖方式的发展,养殖规模不断扩大、密度增加,凡纳滨对虾面临的细菌病和病毒病威胁越来越严重。多种病毒病具有传播速度快、发病率高、致死率高等特点13,给对虾养殖业带来了严重的经济损失。近年来,本实验室多次在上海地区的对虾养殖场中检测到 DIV1 和副溶血弧菌10。本研究于 2022 年 3 月至 2023 年 3月对上海市 3 个主养区采集的 51 批次样品进行副溶 血 弧 菌 分 离,DIV1、WSSV、TSV、IHHNV、CMNV、EHP、VpAHPND等病原检测,8 种病原的阳性总检出率为 6.86%。其中 TSV 未检出,这与施慧等14于 20092010 年对浙江地区凡纳滨对虾苗种场调查的结果以及王筱珊等15于 20152016 年在江苏地区调查的结果相一致。自 2009年起全国多地均未检测到 TSV,表明桃拉综合征病毒在我国多地已得到了有效控制。WSSV 和EHP 未检出,IHHNV 的检出率为 3.92%,这一结果与郑晓叶等13报道的浙江省凡纳滨对虾苗种WSSV 检出率为 1.55%、EHP 检出率为 31.78%、IHHNV 检出率为 20.93%的结果,以及王筱珊等15报 道 的 江 苏 地 区 对 虾 WSSV 检 出 率17.20%、IHHNV 检出率 39.48%的结果存在差异,表明 WSSV、EHP、IHHNV 在不同地区的携带情况存在差异,也有可能是因为 2022 年 35 月上海市因疫情防控,物品、人员和虾苗流动较少,而 68 月平均气温高,进一步降低了病原的传播。李小平等6对河北、山东、浙江、福建、广东和海南等地区对虾的调查发现,2016、2017 年CMNV 在对虾中的阳性检出率分别为 26.8%和16.3%。本研究未检测到 CMNV,表明 CMNV 在不同地区的携带情况不同,可能在上海地区的携带率较低。TSV 和 CMNV 都是 RNA 病毒,容易发832水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(4)生变异,变异后的病毒用 OIE 规定的引物无法检出,抑或是目前这两种病毒携带率低?究竟是什么原因造成的检出率低,目前尚无法定论。孙卫芳等16对广东沿海地区养殖凡纳滨对虾的调查发现,VpAHPND携带率为 2.38%,与本研究 VpAHPND携带率为1.96%的检测结果基本一致,说明上海地区 VpAHPND的携带率较低。本研究通过平板分离到副溶血弧菌 10 株,副溶血弧菌的检出率为 19.61%,而安伟等10于 20142016 年对上海市凡纳滨对虾主养区 52 株不同来源弧菌的分析鉴定结果,副溶血弧菌占比达 57.7%,这表明通过持续的技术指导和养殖户病害防治意识的提高,目前上海地区副溶血弧菌的检出率已呈逐年下降的趋势。高晓华等1对从上海某养殖场患病凡纳滨对虾分离到的一株副溶血弧菌的研究发现,该菌株对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星等药物敏感,这一结果可为副溶血弧菌的药物防控提供参考。郑晓叶等13通过对浙江省 4 个地区凡纳滨对虾苗种场的调查发现,DIV1 病原阳性检出率为37.21%。本研究中,DIV1 的检出率为 29.41%,并且是在 3 个主养区的 5 家养殖场同时检测到,说明不同地区的 DIV1 携带率均相对较高。近年来 DIV1 在全国呈一定的流行趋势,在上海地区也有一定的传播风险。不过由于 DIV1 的标准检测方法为套式 PCR,检出的15 个阳性均为第二轮PCR 检出,表明病毒携带量较低。针对阳性批次,本实验室及时对相关养殖场开展了预防控制技术指导,并持续进行跟踪检测,后续在凡纳滨对虾养殖周期内基本未出现 DIV1 暴发情况。目前尚无关于 DIV1 的防控措施的相关报道,也缺乏有效药物治疗的研究。有研究表明,调控养殖水温可以作为预防 DIV1 的措施之一,当水温在(24.63.3)时,有利于 DIV1 病毒增殖,从而诱发疾病发生17。当养殖水温在 1632 时,可在对虾体内检测到 DIV1,而当水温高于 32 时则不能检出18-19。绳秀珍等8建议要做好放养前的池塘消毒工作,避免污染源进入,同时应投放品种优良、抗性良好的 SPF 虾苗,并采用合理的养殖密度等来预防疾病发生。作为新的病原,目前 DIV1 病毒的生物学特性、感染宿主的分子机制及宿主的应答机制等还有待进一步研究,对病害的防控具有一定难度。本研究结果显示,上海地区养殖凡纳滨对虾的病原携带率处于较低水平,说明各养殖场在虾苗引进质量控制、强化苗种检疫及建立绿色健康养殖模式等方面取得了一定的成效,虹彩病毒、副溶血弧菌是上海主养区凡纳滨对虾携带的主要病原,在实际生产中应根据病原流行特点,从苗种选购、养殖过程管理、药物选用等方面进行防控,采取综合防控措施来减少病害的发生。参考文献1高晓华,张海强,安伟.凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病致病菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察J.淡水渔业,2022,52(3):82-90.2QIU L,CHEN M M,WAN X Y,et al.Characterization of a new member of Iridoviridae,Shrimp hemocyte iridescent virus(SHIV),found in white leg shrimp(Litopenaeus vannamei)J.Scientific Reports,2017,7(1):11834.3肖广侠,李战军,孟宪红,等.白斑综合征病毒(WSSV)3 种PCR 检测方法的灵敏度比较J.中国水产科学,2011,18(3):667-673.4金立方,余招锋.桃拉病毒感染对南美白对虾血液学参数的影响J.农业与技术,2013,33(10):14-16.5范东东,魏永伟,苗亮,等.罗氏沼虾(Macrobrachium rosenber-gii)传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的流行病学调查J.海洋与湖沼,2015,46(5):1153-1159.6李小平,万晓媛,张庆利,等.20162017 年中国沿海省市虾类偷死野田村病毒(CMNV)分子流行病学调查J.渔业科学进展,2019,40(2):65-73.7陈晓玲,朱文博,李淑翠,等.日照地区养殖凡纳滨对虾肝肠胞虫病的检测及分析J.水产科技情报,2020,47(1):27-32.8绳秀珍,吴明顺,叶海斌,等.十足目虹彩病毒 1 的研究进展J.水产学报,2022,46(5):721-729.9国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测 PCR 法:GB/T 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surveillance and analysis of 8 epidemic pathogens of Litopenaeus vannamei in the main culture area of ShanghaiZHANG Xiaoming,AN Wei,ZHANG Minghui(Shanghai Fisheries Research Institute,Shanghai Fisheries Technical Extension Station,Shanghai 200433,China)Abstract:In order to further understand the epidemic trend and characteristics of Litopenaeus vannamei in Shanghai,the epidemiological surveillance and analysis of 8 kinds of epidemic pathogens were carried out regularly.The results of molecular detection and bacterial isolation and identification of 51 samples showed that 4 kinds of pathogens were detected positive,and the positive detection rates were 29.41%for decapod iridescent virus 1(DIV1),3.92%for infectious hypodermic and hematopoietic necrosis virus(IHHNV),1.96%for Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease(VpAHPND),19.61%for Vibrio parahaemolyticus(Vp).However,White spot syndrome virus(WSSV),Taura syndrome virus(TSV),covert mortality nodavirus(CMNV)and Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)were not detected.Among the 408 pathogen detection results,the total positive number of 4 pathogens were 28 and the total positive rate was 6.86%.The results showed that the patho-gen carrying rate of L.vannamei cultured in Shanghai was at a low level,and DIV1 and V.parahaemolyticus were the main pathogens.According to the epidemic characteristics of pathogens,comprehensive prevention and control should be carried out from shrimp larvae selection,farming process management and drug selection to reduce the occurrence of diseases.Key words:Litopenaeus vannamei;decapod iridescent virus 1(DIV1);Vibrio parahaemolyticus acute hepatopan-creatic necrosis disease(VpAHPND);Vibrio parahaemolyticus(Vp);infectious hypodermic and hematopoietic necro-sis virus(IHHNV);Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)042水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(4)