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实验 12 植物组织中可溶性糖含量的测定

在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。
Ⅰ 蒽酮法测定可溶性糖
一、原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
任何植物鲜样或干样。
（二）试剂
1. 80 ％乙醇。
2. 葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。
3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。
（三） 仪器设备
分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。
三、实验步骤
1. 样品中可溶性糖的提取 称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。
2. 标准曲线制作 取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。

表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量
试 剂
管 号
0
1
2
3
4
5
100 μg/mL 葡萄糖溶液（ mL ）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ mL ）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蒽酮试剂（ mL ）
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
葡萄糖量（ μg ）
0
20
40
60
80
100

将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。
3 ．样品测定 取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。
四、结果计算

式中： C ——从标准曲线查得葡萄糖量， μg 。
V T ——样品提取液总体积 , mL 。
V 1 ——显色时取样品液量， mL 。

W ——样品重（ g ）。

Ⅱ 苯酚法测定可溶性糖
一、原理
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在 10 ～ 100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在 485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160 min 以上。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜的植物叶片。
（二）试剂
1. 90 ％苯酚溶液：称取 90 g 苯酚（ AR ），加蒸馏水溶解并定容至 100 mL ，在室温下可保存数月。
2. 9 ％苯酚溶液：取 3 mL 90 ％苯酚溶液，加蒸馏水至 30 mL ，现配现用。
3. 浓硫酸（比重 1.84 ）。
4. 1 ％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在 80 ℃下烘至恒重，精确称取 1.000 g ，加少量水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，加入 0.5 mL 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
5. 100 μg/L 蔗糖标准液：精确吸取 1 ％蔗糖标准液 l mL 加入 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。
（三）仪器设备
分光光度计，电炉，铝锅， 20 mL 刻度试管，刻度吸管 5 mL 1 支、 l mL 2 支，记号笔，吸水纸适量。
三、实验步骤
1 ．标准曲线的制作 取 20 mL 刻度试管 11 支，从 0 ～ 10 分别编号，按表 24 – 2 加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入 1mL 9 ％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5 ～ 20 s 时间加入 5 mL 浓硫酸，摇匀。比色液总体积为 8 mL ，在室温下放置 30 min ，显色。然后以空白为参比，在 485 nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

表 24-2 苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量
试 剂
管 号
0
1 、 2
3 、 4
5 、 6
7 、 8
9 、 10
100μg/L 蔗糖标准液（ mL ）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ mL ）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
蔗糖量（ μg ）
0
20
40
60
80
100

2 ．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取 0.1 ～ 0.3 g, 共 3 份，分别放入 3 支刻度试管中，加入 5 ～ 10 mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取 30 min （提取 2 次），提取液过滤入 25 mL 容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3 ．测定 吸取 0.5 mL 样品液于试管中（重复 2 次），加蒸馏水 1.5 mL ，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，计算测试样品中糖含量。
四、结果计算
可溶性糖含量（％） =
式中： C ——标准方程求得糖量， μg 。
V T ——提取液体积， mL 。
V 1 ——吸取样品液体积， mL 。
W ——组织重量， g 。

Ⅲ 3 ， 5 –二硝基水杨酸比色法测定还原糖
一、原理
3 ， 5 –二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。在 540 nm 波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
食用面粉。
（二）试剂
1. 1 mg/mL 葡萄糖标准液：准确称取 100 mg 分析纯葡萄糖（预先在 80 ℃烘干至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100mL 的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，置冰箱中保存备用。
2. 3,5 - 二硝基水杨酸试剂： 3,5 - 二硝基水杨酸 6.3 g ， 2 mol/L 的 NaOH 溶液 262 mL ，加到 500 mL 含有 185 g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5 g 结晶酚和 5 g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000 mL ，贮于棕色瓶中备用。
（三）仪器设备
离心机，电子天平，分光光度计，大离心管或玻璃漏斗， 100 mL 烧杯， 100 mL 三角瓶，刻度试管，刻度吸管 1 、 2 、 10 mL ，沸水浴，容量瓶。
三、实验步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线 取 7 支具有 25 mL 刻度的刻度试管编号，按表 24–3 所示的量，精确加入浓度为 1 mg/mL 的葡萄糖标准液和 3,5 –二硝基水杨酸试剂。

表 24-3 绘制葡萄糖标准曲线的试剂量
试 剂
管 号
0
1
2
3
4
5
6
1 mg/mL 葡萄糖标准液（ mL ）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
蒸馏水（ mL ）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
3,5 –二硝基水杨酸试剂（ mL ）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5

1.5
相当于葡萄糖量（ mg ）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2

将各管摇匀，在沸水浴中加热 5 min ，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至 25 mL 刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入 21.5 mL 蒸馏水，混匀）。在 540 nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取 1 ～ 6 号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。
2. 样品中还原糖的测定
（ 1 ）样品中还原糖的提取 准确称取 3 g 食用面粉，放在 100 mL 的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 50 mL 蒸馏水，搅匀，置于 50 ℃恒温水浴中保温 20 min ，使还原糖浸出。离心或过滤，用 20 mL 蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在 l00 mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（ 2 ）显色和比色 取 3 支 25 mL 刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液 2 mL ， 3 ， 5 –二硝基水杨酸试剂 1.5 mL ，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。分别在标准曲线上查出相应还原糖毫克数，计算还原糖百分含量。
四、结果计算

式中： C ——标准曲线方程求得的还原糖量， mg 。
V T ——提取液的体积， mL 。
V 1 ——显色时吸取样品液体积， mL 。
W ——样品重， g 。

Ⅳ 斐林试剂比色法测定还原糖
一、原理
植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的 Cu 2+ 还原成 Cu + ，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在 590 nm 波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。
（二）试剂
1. 斐林试剂 A 液： 40 g CuSO 4 · 5H 2 O 溶解于蒸馏水定容至 1000 mL 。
2. 斐林试剂 B 液： 200g 酒石酸钾钠（ KNaC 4 H 4 O 6 · 5H 2 O ）与 150g NaOH 溶于蒸馏水中，并定容至 1000 mL 。
A 、 B 两液分别贮存，使用前等体积混合。
3. 0.1 ％葡萄糖标准液：取 80 ℃下烘至恒重的葡萄糖 0.1000 g ，加蒸馏水溶解，定容至 100 mL 。
4. 0.1mol/LNaOH 。
5. 甲基红指示剂： 0.1 g 甲基红溶于 250 mL 60 ％乙醇中。
6. 10 ％ Pb(Ac) 2 。
7. 饱和 Na 2 SO 4 。
（三）仪器设备
分光光度计，分析天平，离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，容量瓶，研钵。
三、实验步骤
1 . 标准曲线的制作 取 7 支试管，按表 24 – 4 分别加入各溶液。
表 24-4 还原性糖测定时绘制标准曲线的试剂量
试 剂
管 号
0
1
2
3
4
5
6
0.1 ％葡萄糖标准液（ mL ）
0
1
2
3
4
5
6
蒸馏水（ mL ）
6
5
4
3
2
1
0
每管含葡萄糖量（ mg ）
0
1
2
3
4
5
6
斐林试剂（ mL ）
4
4
4
4
4
4
4

将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热 15 min 。取出后自来水冷却， 1500 r/min 离心 15 min 。取上清液，用分光光度计在 590 nm 波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品中还原糖的提取 取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取 3.00 g ，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为 10 ～ 15 mL 时，加 2 ～ 3 滴甲基红指示剂，如呈红色，可用 0.1 mol/L 的 NaOH 中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉 3.00 g ，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入 250 mL 容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。
将大试管置于 80 ℃的恒温水浴中保温 30 min ，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加 10 ％ Pb(Ac) 2 ，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和 Na 2 SO 4 除去多余的铅离子。 30 min 后取出冷却，将提取液全部转入 100 mL 容量瓶中。定容至刻度，摇匀后过滤待测。
3. 样品测定 吸取 6 mL 待测液，加 4 mL 斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在 590 nm 波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。
四、结果计算

式中： C ——标准曲线方程求得的还原糖量， mg 。
V T ——提取液的体积， mL 。
V 1 ——显色时吸取样品液体积， mL 。
W ——样品重， g 。

[ 思考题 ]
1. 简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。
2. 干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些 ? 怎样避免 ?