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水体污染物对淡水贝类抗氧化系统的影响
一、实验目的：
重金属以及化学农药(除草剂)残留和多化芳烃等有机污染是造成我国淡水水体污染的主要污染物。贝类属于敏感型底栖生物，对水质的要求比较高。可作为水环境污染物危害的指示物。同时，生物体内抗氧化酶活力的高低可反映机体的抗病力。本实验拟采用酶分析法探讨水体污染物对淡水贝类抗氧化系统及主要抗氧化酶的影响。对培养学生从事水生生物免疫学研究具有重要的指导意义。
二、实验原理：
水体污染可对贝类造成氧化胁迫，产生大量的活性氧族（ROIS），ROIS能诱发贝类的抗氧化防御系统对其作出应激反应。抗氧化系统的变化情况反映了机体免疫力的高低。通过测定实验蚌抗氧化系统的主要指标（SOD活性、CAT活性、GPX活性、GSH含量、ROS含量）和半定量检测主要抗氧化酶（SOD、CAT、GPX）的表达变化，研究各种胁迫条件下淡水蚌的敏感指标，用于诊断环境污染以及评价污染物对淡水蚌的毒性效应。
三、仪器、设备、及试剂：
冷冻离心机1台，碾砵 10个，起蚌器 5只，分析天平2台（0.01g），液氮罐 1个，分光光度计1台、匀浆器、剪刀、镊子、1mL注射器、10ml的离心管、水族箱或塑料框（50L）8个、充氧泵 4个、联苯胺 25g、考马斯亮蓝G-250（分析纯）25g、牛血清白蛋白（分析纯）25g、硫代巴比妥酸 （分析纯）10g、30% 的H2O2 （分析纯）、500ml 1瓶、正磷酸 500ml，1瓶、谷胱甘肽 (GSH)测定试剂盒 100次/盒 ，南京建成生物公司；3个；谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒100次/盒，南京建成生物公司；3个； 10ml注射器、100支，10ml离心管、100支
10ml试管、100支，100ml烧杯、 2个，500ml，2只；1000ml，2只，容量瓶500ml,100ml 各2个；广口瓶1000，2000ml各2个，匀浆器 10ml 30支；移液枪 1mL, 100µL, 5mL支 各一支。 水浴锅，一台

四、实验内容

内容一、重金属和有机污染物对褶纹冠蚌的胁迫 （8课时）
1、仪器\试剂和设备
PH计、量筒、烧杯、滤纸，硫酸锌或硫酸铜、苯酚或联苯胺、水族箱、充氧泵
2、方法
选择壳长为(9.66±1.07)cm、壳高(6.58±0.85)cm的健康蚌，在水族箱中暂养一周以上，水温控制在20℃、PH 6.8-7.0，保持水中通气(连续冲气暂养)，每天换水一次。
将120只褶纹冠蚌随机分成6组，每组24只，其中一组作为对照，不加入其他任何物质，其他5组用于实验，实验组中3组分别加入重金属（铅或锌）使终浓度为2mg/L（高浓度组）、1mg/L（中浓度组）、0.5mg/L（低浓度组），两组加入有机污染物（联苯胺或苯酚）使终浓度为（高浓度组）、低浓度组。
各种缓冲液的配制。

内容二、酶原液的提取（8课时）
1、仪器\试剂和设备
注射器，离心管、阿氏液、天平、离心机等
2、血清样品的制备 重金属和有机物胁迫后，在0、12、24、48、72、96h分别用2.5mL注射器5号针头从对照组和实验组蚌闭壳肌血窦中取血约1.5mL, 每个时间段每组取4只，以3600 r／min的转速低温(4℃)离心10min，移出上清液，获得实验所用血清样品，置于4℃冰箱中备用。
3、肝胰脏提取液的制备 蚌取血后，取出适量肝胰脏，滤纸吸干水分后称重，加入无菌生理盐水(0.9%)于冰浴中匀浆，使浓度达到0．1 g／m L，在4℃条件下，以3000 r／min离心l0 min，除去沉淀后获得蚌的肝胰脏组织提取液，并以其作为酶原液进行酶活性测定，置于4℃冰箱中备用。

内容三、蛋白浓度的测定 考马斯亮蓝G-250比色法（8课时）
1. 目的
    学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、 原理
    考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。

    由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
    在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。
3、实验材料及设备
    （1）材料
    褶纹冠蚌肝胰脏提取液
    （2）仪器
    分光光度计  离心机  电子天平
   （3）器材
    刻度试管： 25mL×9   刻度试管： 10mL×1  移 液 管： 1mL×3  20mL×1
    烧    杯： 250mL×2  50mL×1 离 心 管： 10mL×1 滴    管： 2
    洗 耳 球： 2 坐 标 纸   研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1
4、试剂的配制
    1. 牛血清白蛋白(BSA)标准液（100mg/mL）
精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
    2. 考马斯亮蓝G-250染色液
取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。
5、 操作步骤
    1.  样品液的制备
        按内容2肝胰腺样品制备 
    2. 标准曲线制作及样品测定
        取9支试管，按下表所示顺序操作。

6、结果处理
    1. 由0～5号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，标准曲线的相关系数必须达到0.95以上；
    2. 求样品管A595的平均值A595；
    3. 由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)；
    4. 计算每个样品中蛋白质的含量（单位用mg/g鲜重）。

内容四、CAT活性测定（氮蓝四唑法）（8课时）
1、原理
在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性物质 ，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2、仪器
荧光灯管、离心机、分光光度计、PH计。
3、试剂
（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（L-Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA-Na2），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
试剂配制：
（1）：0.05mol/L的PBS, PH=7.8
（2）130mmol/L L-Met: 1.9399g L-Met用PBS定容至100ml.
（3）750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS 定容至100ml.(避光保存)
（4）100µmol/L EDTA-Na2：0.03721g用PBS 定容至1000ml.
（5）20µmol/L 核黄素：0.0753g用蒸馏水定容至1000ml
4、测定步骤
（1）酶液的制备：同上，测定血清和肝胰腺的SOD活力。
（2）酶反应酬体系液的制备：加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml，L-Met（甲硫氨酸）: 0.3ml, NBT（氮蓝四唑）: 0.3ml, EDTA-Na2, 0.3ml, 核黄素，0.3ml, 酶液，0.05ml, 蒸馏水：0.25ml，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25~30μL酶液。在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。停止光照。在560nm波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。
5、结果计算
以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位。按下式计算：
式中 s——样品照光后的透光度；
a——未加酶之反应液照光后透光度；
b——未加酶之反应液照光前透光度；
n——酶液稀释倍数。
样品酶活单位表示：SOD酶活单位（U）/g干重（g鲜重或g蛋白）。
6. 注释
（1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。
（2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。
照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值。
2、MDA的测定
试剂配制：
（1）：5% TCA(三氯乙酸), 5g 用蒸馏水定容至500ml.
（2）0.5% TBA(硫代巴比妥酸): 2.5g用TCA定容至500ml.
方法：
酶液1ml—3ml0.5%TBA混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值

内容五、SOD活性测定 （8课时）
1、目的
了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法
掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算
2、原理
过氧化氢酶（Catalase，CAT，EC 1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一，其催化的反应为：

通过上述反应，CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。
传统测定CAT活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优点。
测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于H2O2在240nm处有吸收峰，加入酶液后会使A240下降，而A240下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240·min-1，最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240·min-1·g-1Fw并以此来表示样品中CAT活力的大小。
3、实验材料及设备
1. 材料
上述制备的血清和肝胰腺匀浆液
2. 仪器
电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计
3. 器材
刻度试管、 移 液 管、微量进样器、塑料离心管、小 试 管 滴 管 洗 耳 球 、 硫 酸 纸
4、试剂的配制
试剂配制：
(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml
5、操作步骤
1. 粗酶液的制备
略
2． 酶活力测定
(1) 紫外分光光度计与记录仪相连接，波长定于240nm处，记录仪的量程定于 50mV处，预热10min，仪器调零。
(2)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零
(3) 在光径为1cm的石英比色皿内，先加入3mL CAT反应液，再加0.1mL的血清或肝胰腺样品（视酶活力大小而定），用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次（不要过分剧烈颠倒）；立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min处，A240的变化情况被记录于纸上。3min后关闭纸速开关。
(3) 重复步骤（2），再测定1～2次。
6、结果处理
1. 在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值，得ΔA240·min-1，（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收A240），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值；
2. 根据活力测定的酶液加入量、酶液总体积和样品鲜重，计算植物样品中CAT活力，以ΔA240·min-1·g-1Fw表示（包括粗酶液与初步纯化的粗酶液）。

内容六、谷胱甘肽过氧化酶活力测定（8课时
1、测定原理
谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
H2O+2GSH→2H2O+GSSG
谷胱甘肽的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这二个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称非酶促反应）,所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。
GSH量的测定:GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。
2、仪器和设备

分光光度计、37℃恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、蒸馏水
谷胱甘肽过氧化酶（GPX）测试盒（南京建成生物有限公司）具体使用按操作说明书。
二、试剂组成与配制
1.储备液（100T为1ml 1瓶，50T为2ml 1瓶）用时取0.1ml加蒸馏水至10ml，也就等于是100倍稀释配成应用液。现用现配，4℃保存。
2.甲粉，乙粉，各1瓶，甲加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加170ml，50T加85ml）；乙粉加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加50ml，50T加25ml）。将已经配好的甲乙两种溶液混合，室温静置冷却后如有结晶，取上清进行实验。4℃或室温保存
3.粉剂，1瓶，加蒸馏水溶解（100T加200ml，50T加100ml）
4.粉剂（100T）加蒸馏水50ml溶解；液体（50T）直接加量。避光4℃保存
5.粉剂（100T4支，50T2支）每支加蒸馏水10ml溶解，4℃保存。
6.GSH标准品粉剂3.07mg/支（100T4支，50T2支）
7.标准品溶剂储备液，1瓶（100T为10ml，50T为5ml），标准品溶剂应用液：储备液：蒸馏水=1：9，现用现配，4℃保存。
GSH应用液的配制：
1mmol/LGSH溶液 GSH的分子量为307，每次测定前将1支3.07mg的GSH标准品粉剂加到GSH标准品的溶剂应用液中，定容至10ml即为1mmol/L的GSH溶液，现用现配。、
100umol/LGSH溶液 取1mmol/LGSH溶液2ml加GSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml，作标准曲线用，若不做标准曲线可以不配。（见附录）
20umol/L的GSH标准溶液，取1mmol/LGSH溶液0.2ml加GSH标准品溶剂应用液定容至10ml，即为20umol/L的GSH标准溶液。
全血中GSH-PX活力的测定
见说明书。

内容7 GSH活性测定（8课时）
1、原理
二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可以进行比色定量测定。
2、设备
721或722分光光度计
试剂及操作见说明书。

内容8、 数据处理，SPSS软件的使用（8学时）

注：学生参与设计的内容：
水体污染物：可选用（1）病原体污染物（嗜水汽单胞菌、柱状黄杆菌等）；（2）无机氮、无机磷等；（3）有毒重金属污染物，如汞（Hg）、镉(Cd)、铬(Cr)、铅(Pb)、钒(V)、钴(Co)、钡(Ba)、锌（Zn）、砷（As）、硒（Se）和铜（Cu）等。（4）有机农药、多氯联苯，酚和氰酚类化合物；（5）致癌物质：稠环芳香烃(PAHs)，如3，4-苯并芘等；杂环化合物，如黄曲霉素等；芳香胺类，如甲、乙苯胺，联苯胺等，微囊藻毒素。
2、淡水蚌 可选用褶纹冠蚌、三角帆蚌、背角无齿蚌，中华圆田螺等。
3、测定其他抗氧化系统的指标

参考书：
陈建勋 王晓峰主编的《植物生理学实验指导》