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保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌相互作用的研究

摘要：探讨了嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌之间的相互作用(拮抗和共生效果)，指出这两个菌种的许多菌株在代谢过程中会产生过氧化氢、细菌素等抑菌性物质，导致嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌间表现出非协同生长的现象。在此基础上，建立了评价发酵剂之间相互作用的新的指标体系，旨在方便优良酸奶发酵剂菌种的筛选工作。
关键字：嗜热链球菌；保加利亚乳杆菌；共生；拮抗

0 引言
普通酸奶发酵剂是由保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌共同制备的，两菌种之间的共生作用已被广泛认可。然而，近年来的大量研究表明，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌之间存在不协同生长的现象鉴于酸奶最终质量的好坏与酸奶发酵剂密切相关，重新讨论二者之间的相互关系，探索影响二者之问协同生长的各种因素，生产中就能因势利导，控制其维持良好的比例状态，提高酸奶产品的最终质量。此外，加强保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌两者关系的研究，对于研制稳定高效的直投式酸奶发酵剂也是极为有益的。本文对保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌问的相互作用的机理作了探讨，特别是对考察两菌种间相互关系的检测方法作了重点评述，并建立了评价酸奶发酵剂优劣的指标体系，以期为筛选出适用于工业化生产的优良菌株提供重要的科学依据。
1 两者之间的相互影响
1．1 共生作用
众所周知，与两者单独培养相比，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合培养后的产酸速度非常快，因为混合培养过程将促进两者维持更好的生长(见图1)。1 950年，Pette等人首次证实保加利亚乳杆菌发酵乳中的无菌过滤物可以促进嗜热链球菌的生长。进一步的研究指出，刺激嗜热链球菌生长的这种过滤物中富含氨基酸。其后orla—Jensn等的研究发现，强热处理的乳可以加速保加利亚乳杆菌的产酸过程，因为热处理的乳中含有甲酸钠，甲酸钠可以促进保加利亚乳杆菌的生长。，由于甲酸来源于加热处理过程中乳糖的分解，所以，人们在很长一段时间中忽略了嗜热链球菌在促进保加利亚乳杆菌生长中的作用。事实上，在无
氧或氧含量很低的情况下，嗜热链球菌能代谢产生一些促进保加利亚乳杆菌生长的化合物，从而提高保加利亚乳杆菌的酸化活力。Veringa等”研究发现，嗜热链球菌刺激保加利亚乳杆菌生长的促进物质是甲酸。Higashio等旧l发现，除甲酸是必需的生长刺激物外，丙酮也能够刺激保加利亚乳杆菌的生长，而且其它有机酸可以取代丙酮酸的这一作用效果。由于乳酸菌能够利用这些有机酸并形成丙酮酸，所以其他有机酸对保加利亚乳杆菌的生长也有一的促进作用。大量的实验证实，在酸奶菌种混合培养过程中，甲酸并不是促进保加利亚乳杆菌生长的唯一物质“。如在乳中生长时嗜热链球菌可产生CO2，CO2能在一定程度上刺激酸奶发酵剂中保加利亚乳杆菌的生长|4J。Raiagopal等⋯研究发现，九株嗜热链球菌菌株与保加利亚乳杆菌的混合培养物在蛋白质水解活性上存在良好的协同作用，结果如表1所示。

培养时fnJ／h
—一 LB： -- —St：--—LB+ST
图1 保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌(单独或混合)的酸化活力(42℃)
1．2 拮抗作用
近年来的研究表明，尽管嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌两个种之间存在协同共生作用，但并非所有的菌株之间都是共生的。事实上，它们的菌株之间仍然存在不同程度的拮抗抑制作用。Vinderola和Moc—chivittil6I研究了嗜热链球菌无细胞发酵液对保加利亚乳杆菌菌株的生长状况的影响。结果表明，当培养液中含有嗜热链球菌无细胞发酵液时，保加利亚乳杆菌菌株Dbl，Eb3，Eb4和Hb2等的生长受到明显的抑制，而Abl和Ab2两个菌株受到的抑制较弱。他们进一步考察了保加利亚乳杆菌无细胞发酵液对嗜热链

表l 巴氏脱脂消毒奶中嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的水解蛋白活性及生长状况

pH值 酪氨酸/（mg·L-1） Lb★★ St★★
发酵剂 0h 2h 4h 0h 2h 4h 0h 2h 4h 0h 2h 4h
LBRl+STCRl5 6.60 6.22 5.27 0 11.5 52.9 6.20 6.74 7.18 6.57 7.9l 8.85
LBCRl4+STCRl4 6.60 6.06 5.09 0 29.6 117.8 6.53 6.90 7.00 6.64 7.91 9.00
LBCH3+STCH3 6.60 6.10 4.82 0 8.1 140.2 5.80 6.95 8.11 5.76 7.94 8.79
注：★ 培养条件为4小时，42℃；★★为活菌数用对数（lg）表示，单位mI,-1,
球菌菌株生长的影响。结果表明，嗜热链球菌菌株175和Dcl的生长明显受到保加利亚乳杆菌无细胞发酵液的抑制。在实验的64 x,l菌株组合中，仅有12对菌株间存在共生作用，即80％的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌株间存在拮抗作用。这些实验数据反映了嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的某些菌株之间的确存在拮抗抑制作用，它们之问不可能表现出协同生长的
能力(结果见表2)。Bielecka和MajkaowskaI 71在研究了366对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株间的协同生长后发现，仅有下列8对菌株间(7046和6086，151和Mk一10，BI和Bs'bg和As，Cl和Cs，IBI』和IBs，ZBL和ZBs以及Db，和T。M，)存在协同共生作用，即保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株间的非协同生长的比例为97．9％。

表2 嗜热链球菌对保加利亚乳杆菌生长的影响

嗜热链球 保加利亚乳杆菌菌株
菌菌株 Ab1 Bb1 Cb1 Db1 Eb3 bEb4 Cb1 Hb2
A4 - - - + + + - -
A5 - + + + + + - +
A10 - + + + + + - +
A3 - + + + + + - +
175 + X X X X X + X
176 - + + + + + -
Cc1 + + + + + + + +
Dc1 + X X X X X + X
注：x为完全抑制；+为部分抑制；一为没有影响。
1 引起协同生长不平衡的因素
除以乳酸作为最终代谢产物外，乳酸菌还能够产生细菌素、其他形式的有机酸、H：O：、乙醇和罗伊氏素(Feuterin)等多种抑菌物质。这些抑菌物质不仅能控制食品腐败菌和病原菌的生长和存活，延长食品的货架期，而且对近缘相关的种或菌株也有生长抑制作用。
近年来，有关乳酸菌细菌素的研究报道较多，细菌素是一类具有生物活性的多肽或蛋白类物质，具有抑制近缘相关种或菌株的效果。长期以来，人们在研究生长抑制因素时很少关注德氏乳杆菌所产生的抑制物质和效果，因而传统上德氏乳杆菌是与嗜热链球菌搭配用于乳品的发酵生产。Miteva等在对大量分离获得的德氏乳杆菌菌株产细菌素能力的研究表明，德
氏乳杆菌菌株代谢生成细菌素是一种普遍现象。Van de Guchte和Ehrlich的研究也指出，德氏乳杆菌可以产生除乳酸外的多种抑菌物质，包括过氧化氢和细菌素等生长抑制因素。Vinderola等16I最近的调查表明，德氏保加利亚乳杆菌对嗜热链球菌菌株表现出强烈的抑制作用。显然，当保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌共同培养时，这些生长抑制因子的存在势必会干扰两种菌的协同效果，导致生长不平衡出现。
2.1 过氧化氢的效果
Vandevoorde等认为许多乳杆菌、链球菌和片球菌都能代谢产生过氧化氢，过氧化氢抑菌作用主要来源于它能够产生更多的有活性的、对细胞具有毒素作用的羟基。另外，Monnom等认为过氧化氢可以导致钾离子泄漏，抑制氨基酸和碳水化合物的吸收，达到抑菌的目的。当德氏乳酸乳杆菌和德氏保加利亚乳杆菌无细胞发酵液中的过氧化氢达到(5～10)×10-6时，金黄色葡萄球菌的生长受到显著的抑制。
保加利亚乳杆菌产生的过氧化氢对具有益生作用的乳酸菌有抑制作用。Van de Guchte等的研究发现，添加过氧化氢酶到保加利亚乳杆菌菌株V11007的无细胞发酵液中，就可以消
除其对嗜热链球菌的抑制作用，特别是添加过氧化氢酶后可以使嗜热链球菌表现出高的生长速率，而且提高了最终菌体的细胞数量。此外，即便是对保加利亚乳杆菌物细胞发酵液加热(100℃)处理15 min，也不能缓解其对链球菌的抑制作用。这个实验证明，保加利亚乳杆菌
对嗜热链球菌的抑制作用与过氧化氢的存在有关。
2.2 细菌素的效果
将细菌素分为三类：
①羊毛硫细菌素；
②小分子量热稳定性的非羊毛硫细菌素；
③大分子量热敏感性蛋白质。细菌素的杀菌作用是通过干扰能量生成、大分子化合物的生物合成、膜的运输和渗透作用而实现的。
目前，乳酸菌细菌素的抑菌机制有两种：
①羊毛硫素型，即在一定的膜电位下，羊毛硫型细菌素能吸附于感受菌的细胞膜上，侵入膜内形成通透孔道，允许分子量为0．5 ku的亲水溶液通过并导致钾离子从细胞内流出，细胞
膜失去极化，ATP泄漏，细胞自溶而死亡；
②非羊毛硫素型，该类型的细菌素也是在细胞膜上形成一个亲水孔道，但这个亲水孔道是经膜上特定的受体蛋白介导的，与膜电位无关。它的主要作用是破坏膜功能的稳定性(如能量传导)，而不是破坏膜结构的完整性”。
由于细菌素是对与产生菌亲缘关系较近的菌株具有抑菌活性的蛋白类物质，所以，认为嗜酸乳杆菌对德氏乳酸杆菌的抑制作用主要与细菌素物质的产生有关。
研究表明，乳杆菌之间的生长抑制作用是由细菌素引起的，这种细菌素属于热稳定的、小分子量的非羊毛硫多肽物质。研究证实，嗜热链球菌能够产生细菌素；同样也指出，保加利亚乳杆菌可以产生细菌素，细致研究了保加利亚乳杆菌菌株V11005与德氏乳杆菌菌株V11007之问的相互关系。
他们指出，当在菌株V11005的培养液中添加菌株V11007无细胞发酵液后，42℃培养4 h时，菌株v11005的活菌数较培养开始时下降了1 000倍，24 h后的活菌数为0；而V11 005菌株对照组的活菌数培养4h后增加了40倍(见表3)。进一步的工作表明，V11007菌株的无细胞
表3 VIl005生长在经蛋白酶处理的VIl007的无细胞发酵液中的平板计数结果
注：①德氏保加利亚乳杆菌；②嗜热链球菌；③模式菌株。
发酵液经70～100℃处理15 rain后，可以消除其对菌株VIl005的杀菌作用，但50℃的加热
处理并不影响其杀菌效果。如果用蛋白酶处理菌株v11007的无细胞发酵液，则可以缓解德氏乳杆菌V11007无细胞发酵液对保加利亚乳杆菌V11005的杀菌作用，这意味着菌株v11007无细胞发酵液的抑菌物质属于蛋白类成分(见表4)。

表4 经蛋白酶处理后的V11007菌株无细胞发酵液对V11005菌株生长的影响
处理 T0/ml-1 T4/ml-1
MRS 3.0×103 2.6×105
MRS+α-胰凝乳蛋白酶 3.6×103 1.4×105
SB 2.7×103 3.0
SB30min在37℃ 5.8×103 1.0
SB+α-胰凝乳蛋白酶 3.0×103 2.0×103
注：分别指培养时问为T0，和T4时的活细胞数。
在此基础上，他们讨论了嗜热链球菌CNRN302在菌株VIl007无细胞发酵液存在下的生长情况。结果表明，链球菌菌株CNRN302的生长明显受到抑制，特别是添加对数期的德氏乳杆菌vll007的无细胞发酵液的抑制效果要大于延迟期，而H这种抑制效果既便是加入过氧化氖酶也不能被消除．显然，除了H2O2的抑制效果外，嗜热链球菌CNRN302的生长抑制也与菌株vIl007无细胞发酵液中存在的其他物质有关。，在对菌株V11007的无细胞发酵液进行超滤浓缩并使其通过50 ku的滤膜，截留到的无细胞发酵液对嗜热链球菌CNRN302没有杀菌效果。相反，通过100 ku滤膜所截留到的菌株vIl007无细胞发酵液对菌株CNRN302的生长具有强烈的抑制效果。这表明菌株vIl007的无细胞发酵液中具有杀菌作用的蛋白类物质的分子量变化相：50～100 ku之间。．鉴于这种具有杀菌作用的蛋白物质的分子最处在50～100 ku之间，且具有不耐热的特性，所以按乳
酸荫细菌素分类标准，将它们的蛋白物质归结为大分子量的热敏感型的细菌素。这类细菌素是由染色体基因编码，编码区中存在两个完整的开放的读码框ORF3和ORF2，如由瑞士乳杆菌48l产生的属于此类细菌素，研究表明，当保加利亚乳杆菌菌株Lb．Abl的无细胞发酵液存在时，嗜热链球菌菌株St．A10的生长完全受到抑制，抑制作用的原因也是因为无细胞发酵液存在细菌素类物质。
3 评价拮抗作用的方法
3.1 有机酸抑菌实验分析
由于有机酸具有杀菌作用，为了证明这种抑菌作用不是由于有机酸的存在而发生的，需用的NaOH溶液调整无细胞发酵液的pH值到6．5～7．0之间，消除有机酸的影响，然后，利用中和后的抑制菌发酵液作拮抗试验，判断是否存在其他抑菌物质。
3.2 过氧化氢酶试验
为了确定过氧化氢的抑菌效果，可将待定菌株(保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌)的无细胞发酵液调整至pH中性后，加入过氧化氢酶(质量浓度为5 mg／L)38℃反应1 h，然后与未经处理的发酵液(对照)一起作交叉拮抗试验，判断待定菌株产生的物质是否为过氧化氢。
3.3 蛋白类抑菌物质的确定
为了判断菌株是否产生蛋白类抑菌物质，试验中可将待定菌株的无细胞发酵液pH调整至中性，并分装到Eppendorf管中，然后向发酵液中添加蛋白酶酶液(如蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、d一胰凝乳蛋白酶等)，混匀，在38。C下反应l h，与未经处理的发酵液(对照)一起作抑菌拮抗实验，检查待定菌株产生的抑菌物质是否为细菌素类物质。
4 评价体系
酸奶的质量与发酵剂的优劣密切相关，所以长期以来人们一直在探索如何控制发酵剂的质量。综合以上的讨论并结合前人的研究结果，认为除了从酸化活力、后酸化能力、组织状态稳定性和风味物质产生等方面评价酸奶发酵剂质量的优劣外，应该注重的是不同嗜热链球菌和保加利弧乳杆菌菌株问的协同生长关系的研究，以便选择出生长相互促进且搭配比例稳
定的球菌和杆菌菌株，保证酸奶及其它发酵乳制品的最终质量。
5 小 结
传统上，普遍认为嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌存在共生关系，因为保加利亚乳杆菌在乳中代谢生成的氨基酸可以刺激嗜热链球菌的生长，而嗜热链球菌在代谢过程中产生的甲酸可以促进保加利亚乳杆菌的生长。然而，近年来的许多研究表明，某些嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌菌株之间存在拮抗抑制作用，并不能保证它们在生长过程特别是在酸奶生产过程中
稳定维持1∶1的比例，原因在于嗜热链球菌或者保加利亚乳杆菌中的许多菌株能产生过氧化氢和细菌素等抑菌拮抗物质，结果破坏T球菌与杆菌之间的稳定平衡关系。研究嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌菌株之间的协同(或拈抗)关系，可以为筛选出适合工业化生产的优良菌株以及制备质量稳定的酸奶发酵剂提供重要的科学依据，并在生产中确保发酵剂的质量，从
发酵剂这一环节上来确保酸奶最终产品的质量。