人参皂苷Rg1在小鼠创伤性脑损伤修复中的作用.pdf

Jun.2023,43(3)DOl:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.187等荣誉称号。师长宏，医学博士，教授，博士生导师。目前任空军军医大学（原第四军医大学）实验动物中心主任，陕西省实验动物质量监督检测中心主任。获全国优秀科技工作者、军队育才银奖和中国实验动物学会青年人才奖。兼任中国实验动物学会常务理事、全军实验动物专业委员会副主任委员、陕西省实验动物学会副理事长。主要从事人源化动物模型研究，重点围绕肿瘤模型的制备、影像学评估和应用等开展研究工作。近5年，作为第一作者或通信作者发表SCI论文10 余篇，刊于CancerCell、Bio m a te r ia ls 和NanoResearch等期刊。先后承担国家“8 6 3”专项、军队和省重大科技项目10 余项。获陕西省科技进步二等奖和陕西省教学成果一等奖各1项。人参皂苷Rg1在小鼠创伤性脑损伤修复中的作用郭文文1，赵亚，王颖花，刘可，葛煦，张延英1，汪永锋，师长宏(1.甘肃中医药大学基础医学院，兰州7 30 0 30；2.空军军医大学实验动物中心，西安7 10 0 32；3.甘肃省实验动物行业技术中心，兰州7 30 0 30)摘要】目的探讨人参皂苷Rg1在创伤性脑损伤（traumatic brain injury，T BI）小鼠模型血脑屏障、神经炎症、行为学功能等方面的作用。方法实验分2 部分。第一部分是将2 7 只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、假手术组、TBI模型组，每组9 只；TBI模型组开颅后采用受控皮质冲击（controlledcortical impact，CCl）方式造模，假手术组只开颅不进行打击，空白组不经任何处理；手术后进行造模效果评价。第二部分是将40 只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组、3个剂量的人参皂苷Rg1治疗组和溶剂DMSO对照组，每组8 只小鼠。Rg1治疗组在TBI建模成功后6 h腹腔注射剂量分别为10、2 0、40 mg/kg的人参皂苷Rg1，而DMSO对照组给予等量的1%DMSO，持续给药1周，每天2 次。于造模后1、3、7、14d分别进行改良的神经损伤严重程度评分（modifiedneurologicalseverity scores，m Ns S)；取造模后第3天的小鼠脑组织，采用蛋白质印迹法检测血脑屏障渗漏情况；第14、16 天分别采用高架十字迷宫实验、水迷宫实验检测小鼠神经行为功能；第2 8 天麻醉、灌注后取脑，免疫荧光染色观察小胶质细胞、星形胶质细胞活化等神经炎症。结果人参皂苷Rg1治疗组的血脑屏障标志物MMP-9表达量减少（P0.01），小胶质细胞（Iba-1阳性表达）和星形胶质细胞（GFAP阳性表达）数量均明显减少（P0.05），提示神经炎症得到抑制，且以2 0 mg/kg剂量效果最好（P0.01)。人参皂苷Rg1治疗组小鼠的mNSS评分显著低于溶剂DMSO对照组（P0.01），进入开放臂次数比例显著高于DMSO对照组（P0.05）；其在水迷宫实验平台所在象限的时间比及穿越平台的次数均显著多于DMSO对照组（P0.05），且均以2 0 mg/kg剂量效果最佳。结论成功构建TBI小鼠模型并用于人参皂苷Rg1的损伤修复研究。人参皂苷Rg1能够显著改善TBI模型小鼠血脑屏障，减轻神经炎症，发挥改善神经行为功能的作用，且以2 0 mg/kg剂量作用效果最为显著。基金项目】陕西省创新能力支撑计划-科技资源开放共享平台项目“基于诱导性多潜能干细胞的人神经元嵌合小鼠的制备与评价”（2 0 2 1PT-037)；军队实验动物专项科研课题“人神经元嵌合小鼠的制备与评价（SYDW2018J01)第一作者】郭文文（19 9 6 一），女，硕士研究生，研究方向：神经生物学。E-mail:通信作者】汪永锋（19 6 8 一)，男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：中西医防治消化系统疾病。E-mail:。O R CID：0 0 0 0-0 0 0 3-0560-333x;师长宏（19 7 3一），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：人源化动物模型的制备与评价。E-mail:。ORCID:0000-0001-7490-3593实验动物与比较医学LaboratoryAnimaland ComparativeMedicine汪永锋，教授，硕士生导师，主要研究中西医结合防治消化道疾病。目前任甘肃中医药大学党委常委、副校长，比较医学学科带头人，甘肃省实验动物产业技术创新战略联盟理事长，甘肃省实验动物行业技术中心主任。先后主持国家自然科学基金、省部级课题10 项。获甘肃省科技进步二等奖、三等奖4项，甘肃省皇甫谥医学二等奖、三等奖5项。主编教材及学术著作7 部，参编19 部。发表学术论文9 7 篇，其中SCI论文33篇。作为负责人主持设立甘肃省工信厅认定的“甘肃省实验动物行业技术中心”，省科技厅批准的“甘肃实验动物产业技术创新战略联盟”。先后获得“全国优秀共青团千部”“全国社会实践先进个人”243实验动物与比较药理Experimental Animal and Comparative Pharmacology244【关键词】创伤性脑损伤；人参皂苷Rg1；小鼠；神经炎症；行为学中图分类号】R-332；Q 9 5-33文献标志码 A文章编号 16 7 4-58 17(2 0 2 3)0 3-0 2 43-10Repairing Effects of Ginsenoside Rg1 on Traumatic Brain Injury in MiceGUO Wenwen2,ZHAO Ya,WANG Yinghua,LIU Ke,GE Xu,ZHANG Yanyingl3,WANG Yongfeng,SHIChanghong?(1.Basic Medical College,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730030,China;2.Laboratory Animal Center,Air Force Military Medical University,Xian 710032,China;3.Gansu ProvinceExperimental Animal Industry Technology Center,Lanzhou 730030,China)Correspondence to:WANG Yongfeng(ORCID:0000-0003-0560-333x),E-mail:;ABSTRACTneuroinflammation and behavioral function of traumatic brain injury(TBl)mouse model.Methods Theexperiment was divided into two parts.In the first part,27 SPF male BALB/c mice were randomly dividedinto blank group,sham operation group and TBl model group,with 9 mice in each group.TBl model groupwas made by controlled cortical impact(CCl)after craniotomy,while sham operation group was onlyperformed craniotomy without any treatment,and the blank group was not treated at all.The effect ofmodeling was evaluated after operation.In the second part,50 male BALB/c mice were randomly dividedinto sham operation group,three different drug dosage groups and solvent(DMsO)control group,with 8mice in each group.The drug treatment groups were injected with ginsenoside Rg1 at the doses of 10,20and 40 mg/kg respectively 6 hours after TBI model had been successfully established,while the DMSOcontrol group was given the same amount of 1%DMSO for one week,twice a day.Modified neurologicalseverity scores(mNsS)were performed on the 1st,3rd,7th and 14th day after modeling,and the blood-brainbarrier leakage was detected by Western blotting on the 3rd day after modeling.On the 14th and 16th day,the elevated cross maze test and water maze test were used to detect the neurobehavioral function.Onthe 28th day after anesthesia and perfusion,the brains were taken out,and the neuroinflammation such asactivation of microglia and astrocytes was observed by immunofluorescence staining.Results Theexpression level of MMP-9,a marker of blood-brain barrier,decreased in ginsenoside Rg1 treatment group(P0.01).The number of microglia(lba-1 positive)and astrocyte(GFAP positive)cells decreasedsignificantly(P0.05),which indicated that neuroinflammation was inhibited,and the best effect wasachieved at the dosage of 20 mg/kg(P0.01).The mNSS of mice in ginsenoside Rg1 treatment group weresignificantly lower than those in DMSO control group(P 0.01),and the proportion of times they enteredthe open arm was significantly higher than that in DMSO control group(P 0.05).The time ratio in thequadrant where the water maze experimental platform was located and the times of crossing the platformwere significantly higher than those in control group(P 0.05),and the dosage of 20 mg/kg had the best effect.Conclusion The TBl mouse model was successfully constructed and applied to the study of ginsenosideRg1 repair of mouse traumatic brain injury.Ginsenoside Rg1 can significantly improve blood-brain barrier,alleviate neuroinflammation and improve neurobehavioral function in TBl model mice,and the effect is themost significant at the dose of 20 mg/kg.Key words Traumatic brain injury;Ginsenoside Rg1;Mice;Nervoinflammation;Ethology实验动物与比较医学Laboratory Animal and Comparative MedicineSHI Changhong(ORCID:0000-0001-7490-3593),E-mail:Objective To explore the effects of ginsenoside Rg1 on blood-brain barrier,Jun.2023,43(3)创伤性脑损伤（traumatic brain injury，T BI）主要是由外部机械力引起的脑组织病理学改变或脑功能障碍，如果不及时治疗，将导致长期的认知问题，影响患者进行日常活动和重返工作的能力2 。目前，TBI已成为重要的全球公共卫生问题，每年至少有1 000万例住院或死亡的TBI患者3。Jun.2023,43(3)目前，针对TBI的治疗方法及药物大多局限于康复性或姑息性，尚无法有效恢复神经功能【4。人参皂苷是人参的主要生物活性成分，具有易提取、成本低等优点，其显著的神经保护和神经营养作用受到普遍关注。研究发现，人参皂苷能够发挥抑制神经兴奋性毒性、减轻氧化应激和神经炎症、维持神经递质平衡、促进神经干/祖细胞增殖、促进神经突起生长和神经网络形成等作用，进而显著改善TBI后继发的神经功能损伤5。已有研究证实，人参皂苷的主要成分之一Rg1（分子式为C42H72014，相对分子量为8 0 1.0 1）可以修复TBI后被破坏的血脑屏障，促进体外神经干细胞的增殖、分化，抑制神经细胞凋亡，促进神经再生，若用于颅脑损伤，可能会减轻神经元的继发性损伤6 。人参皂苷Rg1能否促进TBI后的神经发生和神经元再生，并有助于神经功能的恢复，目前国内尚无相关文献报告。因此，本研究从小鼠TBI建模后血脑屏障渗漏、神经炎症及神经行为功能等方面，评估不同剂量人参皂苷Rg1的治疗效果，以期进一步完善中西医结合治疗TBI的策略并探索人参皂苷Rg1的作用价值，为临床治疗TBI提供新的理论基础和实验依据。1材料与方法1.1实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠6 7 只，6 8 周龄，体重2 530g，由空军军医大学实验动物中心SCXK（陕）2 0 19-001提供，均饲养于空军军医大学实验动物中心屏障环境SYXK（陕）2 0 19-0 0 1，室温控制在2 426，光线每12 h明暗交替，自由进食，每周更换2次垫料。相关动物实验方案通过空军军医大学实验动物福利伦理委员会批准（审批号：IACUC-20220830）。1.2主要试剂与仪器人参皂苷Rg1（粉剂，规格1g，纯度9 8%，批号22427-39-0）购自上海源叶生物科技有限公司；先用二甲基亚（DMSO）溶液将人参皂苷Rg1配制成质量浓度为40 0 mg/mL的母液，然后用生理盐水（即0.9%NaCl溶液）稀释为1、2、4mg/mL，一2 0 避光保存备用；用药前根据动物体重和目标剂量10、2 0、40mg/kg计算相应的给药体积。抗基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloprotein-9，MMP-9）抗体（Ab283575）、抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，G FA P）抗体（Ab68428)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine1.3TBI动物模型建立及评价27只小鼠经适应性饲养1周后，随机分为空白组、假手术组、TBI模型组，每组9 只。术前所有动物禁食12h，但自由饮水。TBI模型组根据文献7-8 ，采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBI模型：经异氟烷麻醉后固定小鼠于脑立体定位仪上，在两耳之间正中做一矢状切口，暴露前正中线及前卤点，在前卤后1mm，前正中线左侧2 mm，做直径3mm的颅骨切除手术，暴露硬脑膜，注意在开颅过程中保持硬脑膜完整性；将颅脑损伤打击器的撞击头（直径2 mm）移至该坐标点，调节并校正打击零界面，设置打击参数为打击速度5.6 m/s，深度1.5mm，直径2 mm，打击停留时间1s，造成左脑初级视觉皮层损伤；撞击后及时止血并缝合头皮。假手术组只进行开颅但不撞击。通过脑组织缺损观察和行为学测试评价TBI模型建立效果。1.4药物干预及评价40只小鼠随机分为假手术组、人参皂苷Rg1治疗组（3个剂量）和溶剂DMSO对照组，每组8 只小鼠。假手术组只进行开颅但不撞击；Rg1治疗组小鼠在TBI手术后6 h，腹腔注射剂量分别为10 mg/kg、2 0 mg/k g、40mg/kg的人参皂苷Rg1；溶剂对照组给予等量的1%DMSO。连续给药1周，每天2 次。观察各组小鼠的饮食情况、体重变化等特征，记录其肢体运动、角膜反245和抗离子钙结合衔接分子1（ionized calciumbindingadaptermolecule1，Ib a-1）抗体（Ab178846）均为英国Abcam公司产品；DyLight594荧光标记二抗购自美国Genetex公司；Cy3荧光染料（EK012）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；4，6-二基-2-苯基吲哚（D A PI，10 g/mL）及BCA蛋白浓度测定试剂盒（PA 115-0 2）购自北京雷根生物技术有限公司；蛋白提取试剂盒（P0033）购自上海碧云天生物技术有限公司；SDS凝胶试剂盒（EC0004）为山东思科捷生物技术有限公司产品；聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVD F）膜（YA1701）为美国Millipore公司产品；辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（A T 0 0 0 1）为美国Engibody公司产品。激光共聚焦显微镜（型号LSM800）为德国CarlZeissAG公司产品；脑立体定位仪（型号517 30）为美国Stoelting公司产品；颅脑损伤打击器（型号6 8 0 9 9）、高架十字迷宫（型号6 30 10）和水迷宫（型号6 30 0 3）等行为学设备，以及冰冻切片机（型号FS800A/FS800）均为深圳市瑞沃德生命科技有限公司产品。246射、耳廓反射等基本情况。然后通过蛋白质印迹、行为学测试、免疫荧光染色评价药物作用。1.5小鼠行为学观察随机选用手术建模后的每组9 只实验小鼠以及用药干预后的每组8 只小鼠，进行以下行为学实验。（1）神经功能评分：在TBI建模后第1、3、7、14天进行改良的神经损伤严重程度评分（modifiedneurologicalseverityscores,mNSS)。根据参考文献9-11的神经功能评分判定标准：每出现一个异常行为或缺乏测试条件反射，就得1分；评分范围0 18，分数越高，提示损伤越严重；总分为0 分表示正常，16 分表示轻度损伤，7 12 分表示中度损伤，1318 分表示严重损伤。（2）高架十字迷宫实验：TBI后14d将小鼠置于高架十字迷宫装置的中心（直径10 cm、臂长45cm），由Smart3.0行为学检测系统分别记录5min内小鼠在开放臂及闭合臂的行动路程及探索时间，以评估焦虑及探索行为。（3）水迷宫实验：在神经功能评分及高架十字迷宫实验后，让动物休息2 d。然后，采用海马依赖性行为任务的水迷宫实验来研究小鼠的空间学习和记忆能力。正式实验前所有小鼠自由游泳12 0 s，用以排除与年龄相关的视觉缺陷和运动能力缺陷。然后进行为期4d、每天4次、每次6 0 s的训练，根据随机数字表选择任一象限作为人水点，面向池壁将小鼠放入水中，小鼠在添加非过敏性黑色水粉颜料的圆柱形水池（直径12 0 cm，高度6 0 cm）中找到位于水面以下2 cm(24）的水下平台（直径10 cm）。如果在6 0 s内未找到平台，则将动物引导至平台并停留15s。使用视频跟踪系统记录小鼠寻找平台所需时间。在第5天进行一次6 0 s的探测试验：将平台从池中移出，将小鼠从平台所在象限对侧放人水池，记录小鼠在原平台所在象限的停留时间、穿越平台次数及运动路程，以评估各组小鼠的空间学习及运动能力。1.6脑损伤观察及脑组织取材TBI手术后第2 8 天，小鼠经麻醉后开胸，剪开右心耳，同时左心室插管，先灌注生理盐水（即0.9%NaCl溶液）10 0 mL，然后换用质量分数4%的多聚甲醛溶液灌注2 50 mL。断头后完整取脑，各组随机取2 只小鼠脑组织用于观察组织缺损。再随机选取各组3只小鼠脑组织，放置于4%多聚甲醛溶液中，4温度下保存至少2 4h。然后分别用梯度蔗糖溶液进行脱水，在FS800A/FS800冰冻切片机实验动物与比较医学Laboratory Animal andComparativeMedicine成功建立TBI模型本实验通过脑组织观察、神经功能评分及高架十字迷宫、水迷宫等行为学实验评价受控皮质冲击手术后小鼠的学习、认知及运动功能以确认TBI模型是否成功建立。脑损伤后灌注取脑观察，可见明显的脑挫伤部位（图1A）；T BI 模型组小鼠的神经功能评分显著Jun.2023,43(3)上行冠状连续切片，用于免疫荧光染色。切片厚度为2 0 m，置于一2 0 保存。1.7免疫荧光染色及激光共聚焦观察将切片在PBS（p H 7.4）中洗涤5min，用0.2%Triton20通透10 min，然后进行免疫荧光标记处理。切片在2%BSA中孵育1h后，加人一抗4孵育过夜(GFAP和Iba-1抗体的工作液稀释比例分别为1：2 50、1：50 0)。第2 天在PBS中洗涤3次，将切片与相应的二抗（Dylight594和Cy3荧光标记的二抗工作液稀释比例均为1：50 0）在室温下避光孵育2 h。切片在PBS中洗涤3次，每次5min，避光。细胞核用DAPI溶液（10 g/mL）染色8 min，然后用甘油明胶进行封片。使用激光共聚焦显微镜拍摄照片，并使用ImageJ软件分析区域内阳性细胞数。1.8蛋白质印迹法检测相关蛋白表达TBI手术后第3天，各组取3只小鼠损伤部位的新鲜脑组织，采用蛋白提取试剂盒提取蛋白质。提取的蛋白质于一7 0 保存备用。用BCA蛋白定量法检测样品蛋白质浓度，取50 g蛋白质加人2 xSDS凝胶加样缓冲液中，将样品经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶6 0 V30min，分离胶12 0 V1h）分离。分离后的蛋白质在12 0 V恒压状态下2 h电转移至PVDF膜。PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中，37 封闭2 h。分别加入相应的抗MMP-9一抗（工作液稀释比例为1：2000），与PVDF膜在4培育过夜，与辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（工作液稀释比例为1：40 0 0）于37孵育2 h。采用化学发光底物进行化学发光，暗室曝光，显影定影后用Bio-RADQuantityOne图像分析软件进行扫描分析。1.9统计学处理采用SPSS22.0和GraphPadPrism8.4.0软件进行数据统计学分析，结果以x土s表示。组间比较使用两因素方差分析，应用LSD-t检验进行组内两两比较，以P0.05认为差异具有统计学意义。2结果2.1月Jun.2023,43(3)高于假手术组（P0.01，图1B），进人开放臂次数比例显著低于假手术组（P0.05，图1C），水迷宫实验中其在平台所在象限的时间比及穿越平台的次数均显AControlC50实验动物与比较医学Laboratory Animal and Comparative MedicineSham111315cm-2D#5厂247著少于假手术组（P0.05，图1DE)。结果表明TBI后小鼠神经功能受损，出现了学习、认知及运动功能障碍。BTBI87#*64SSNuI201Time after traumatic brain injury/dE6TBI#Sham*Control#王3579#440304322010210Control注：A，脑组织损伤情况观察（白色箭头所指为TBI后脑组织缺损）；B，神经功能评分（mNSS即改良的神经损伤严重程度评分）；C，高架十字迷宫实验；DE，水迷宫实验。Control即不进行任何处理组；Sham即假手术组；TBI即采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBI模型组，每组9只小鼠。与Sham组比较，*P0.05，*P 0.0 1，*P 0.0 0 1；与Control组相比，#P0.05，#P 0.0 1。Note:A,Observation of brain tissue injury(the white arrow refers to damaged brain region by TBI);B,Neurological function score(mNSS isthe improved nerve injury severity score);C,Elevated cross maze experiment;D-E,Water maze experiment.Control is the blank group withoutany treatment;Sham is the sham operation group;TBl is TBI modeling group by controlled cortical impact method,with 9 mice in eachgroup.Compared with the sham group,*P0.05,*P0.01,*P0.001;Compared with control group,*P0.05,*P0.05，图2)；而与溶剂DMSO对照组相比，经过10 40 mg/kg的人参皂苷Rg1治疗后MMP-9蛋白表达量均明显下降（均P0.01，图2）。结果提示10 40 mg/kg人参皂苷Rgl能够明显改善脑损伤后的血脑屏障功能。2.3人参皂苷Rg1改善脑损伤后神经炎症通过免疫荧光染色检测发现，TBI建模2 8 d的小鼠0ShamControl0TBISham脑组织中小胶质细胞（Iba-1阳性标记）及星形胶质细胞（GFAP阳性标记）在病变区域显著富集，相应地在假手术组小鼠脑组织中未看到Iba-1和GFAP明显表达；与溶剂DMSO对照组相比，经过10 40 mg/kg的人参皂苷Rg1治疗后TBI小鼠脑组织中小胶质细胞及星形胶质细胞活化均显著减少（均P0.05，图3），尤以20 mg/kg效果最显著（P0.01)。2.4人参皂苷Rg1改善脑损伤后小鼠行为学功能在TBI造模之前，各组之间的神经功能评分没有差异（图4A）。T BI造模后第1天、第3天溶剂DMSO对照组小鼠的神经功能评分显著高于假手术组（PShamControl248AMMP-9-actinB1.5 1.00.50Sham注：MMP-9，基质金属蛋白酶-9。Sham即假手术组；DMSO即采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBI模型后的溶剂对照组；10、2 0、40mg/kgRg1即采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBI模型后的10、20、40 m g/k g 人参皂苷Rg1灌胃治疗组，每组8 只小鼠。与DMSO组相比，*P0.01。Note:MMP-9,matrix metalloprotein-9.Sham is the sham operationgroup;DMSO is the solvent control group after TBI modeling bycontrolled corticalimpact method;10mg/kg,20 mg/kg,and 40 mg/kgRg1 are 10,20,40 mg/kg of ginsenoside Rg1 treatment groups afterTBl modeling by controlled cortical impact method,with 8 mice ineach group.Compared with DMSO group,*P0.01.图2 人参皂苷Rg1对小鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的影响Figure 2 Effect of ginsenoside Rg1 on blood-brain barrieraftertraumatic brain injury(TBl)inmice0.01），表明TBI建模后小鼠神经损伤严重。而与溶剂对照组相比，经过10 40 mg/kg的人参皂苷Rg1治疗后，小鼠神经功能评分显著降低（P0.05)。从第7 天到第14天，各剂量人参皂苷Rg1治疗组小鼠的神经功能评分与假手术组小鼠相比逐渐没有显著性差异，表明经过较长时间的Rg1治疗TBI小鼠的神经功能逐渐恢复（图4A）。高架十字迷宫实验显示，与假手术组相比，TBI建模后溶剂DMSO对照组小鼠进人开放臂次数比例显著降低（P0.01)；而2 0 40 mg/kg的人参皂苷Rg1治疗实验动物与比较医学LaboratoryAnimal and ComparativeMedicineRg1DMSO10mg/kg20 mg/kg*1*厂10 mg/kg20mg/kgRg1Jun.2023,43(3)后小鼠进人开放臂次数的比例显著高于溶剂对照组（P0.05，图4B），提示人参皂苷Rg1改善了TBI后小鼠的焦虑情绪。水迷宫实验显示，在隐藏平台获取阶段，几乎所有组小鼠都表现为潜伏期逐渐缩短，表明受试小鼠可以了解平台的位置。但与溶剂DMSO对照组相比，2 0 mg/kg人参皂苷Rg1治疗组小鼠的逃逸潜伏期明显减少（P0.05，图4C）。在第5天训练试验后24h进行了无平台探测测试，结果显示2 0、40 mg/kg人参皂苷Rg1治疗组小鼠的平台穿越次数显著高于溶剂DMSO对照组小鼠（P0.05，图4D）。实验结果提示人参皂苷Rg1治疗显著改善了TBI小鼠的空间学习和记忆能力。3讨论TBI往往以各种形式出现，继而引起中枢神经系统长期且严重损伤。根据损伤的严重程度不同，针对TBI的治疗方法也大有不同，同时治疗手段需要不断更新12 。从日常认知疗法到根治性手术，都需要根据具体情况来制定合适的治疗方案，而中医药作为辅助治疗手段也能发挥明显功效。其中，人参因其“补五脏、镇静身心”的功效被广泛用于治疗精神障碍13。作为人参主要活性成分之一的人参皂苷Rg1具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理活性，已被证明在几种神经疾病动物模型中可用作神经保护剂，改善认知和记忆功能障碍【14。在目前的相关研究中，人参皂苷Rg1的应用剂量多为5 6 0 mg/kg，其中2 0 40 mg/kg剂量效果较为显著【15-18 。因此本实验采用文献7-8 报告的受控皮质冲击方法制备精确模拟TBI的小鼠模型，并通过脑组织缺损观察及相关行为学实验验证TBI模型建立成功与否，然后在TBI模型构建成功6 h后进行10 mg/kg、2 0 m g/k g、40 m g/k g 人参皂苷Rgl干预，并对人参皂苷Rg1的最佳药物作用剂量进行探索。据报告，血脑屏障破坏是由脑血管内皮细胞间的紧密连接与完整的血管系统相断开所导致【19 ，且这种破坏进一步引起了正常神经元生理学微环境的恶化。在大脑中，基质金属蛋白酶对组织形成、神经元网络重塑和血脑屏障完整性至关重要，目前研究得最明确的是MMP-2和MMP-92 0 。虽然药代动力学研究表明人参皂苷Rg1不能被充分转运穿过血脑屏障2 1，但在一些研究中仍然发现人参皂苷Rg1Jun.2023,43(3)AShamIba-1实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineDMSO10 mg/kg249Rg1B20 mg/kg40 mg/kg*3*20ShamOSWa50 umRgl1CShamGFAP10mg/kg20 mg/kg40mg/kgRg1DDMSO10 mg/kg20 mg/kg40 mg/kg*0.8*0.60.40.20.0ShamOSWA50um注：AB为免疫荧光染色法检测各组小鼠脑组织中Iba-1蛋白表达（反映小胶质细胞活性），以及其阳性表达细胞数的统计图；CD为免疫荧光染色法检测各组小鼠脑组织中GFAP蛋白表达（反映星形胶质细胞活性），以及其阳性表达细胞数的统计图。A和C图中，各组上中下3个照片分别表示3只小鼠脑组织中相似层面的3个切片。Sham即假手术组；DMSO即采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBI模型后的溶剂对照组；10、2 0、40 m g/k g 即采用受控皮质冲击方法建立小鼠TBl模型后的10、2 0、40 mg/kg人参皂苷Rg1灌胃治疗组，每组8 只小鼠。与DMSO组相比，*P0.05，*P 0.0 1。Note:A-B show ionized calcium binding adapter molecule 1(lba-1)protein expression(reflecting microglia activity)and the number of Iba-1positive cells in brain tissues of mice in each group detected by immunofluorescence staining.C-D show glial fibrillary acidic protein(GFAP)expression(reflecting the activity of astrocytes)and the number of GFAP positive cells in the brain tissue of mice in each groupdetected by immunofluorescence staining.In Figures A and C,the top,middle,and bottom three photos in each group show three slices ofsimilar layers in the brain tissue of three mice.Sham is the sham operation group;DMSO is the solvent control group after TBl modeling bycontrolled cortical impact method;10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg Rg1 are 10,20,40 mg/kg of ginsenoside Rg1 treatment groups after TBlmodeling by controlled cortical impact method,with 8 mice in each group.Compared with DMSO group,*P0.05,*P0.01.图3人参皂苷Rg1对小鼠创伤性脑损伤2 8 d后小胶质细胞及星形胶质细胞的影响Figure 3 Effect of ginsenoside Rg1 on microglia and astrocytes 28 d after traumatic brain injury(TB