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一株沼泽红假单胞菌对氮磷的同化能力
摘要：采用单因素和正交试验研究了不同营养成分对一株沼泽红假单胞菌氮磷同化能力的影响。结果表明，ｋｈ２ｐｏ４对沼泽红假单胞菌同化氮磷的能力有显著的影响。在同等发酵生物量的情况下，当ｎｈ４ｃｌ为０．０５ ｇ／ｌ、ｋｈ２ｐｏ４为１．４０ ｇ／ｌ、酵母抽提物为１．００ ｇ／ｌ时，可使沼泽红假单胞菌的氮磷同化率分别由原来的32.51％和５．９８％提高到48.02％和７．76％。
关键词：沼泽红假单胞菌；浓度梯度；生物量；氮磷同化
ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ strain
ｌｉｕ ｍｉｎ，ｌｉａｎｇ ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ，ｚｈａｏ ｓｈｕ－ｍｉａｏ，ｘｉｅ ｙｉ－ｔｉａｎ
（ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｈｕａzｈｏｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｗｕｈａｎ ４３００７０，ｃｈｉｎａ）
ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ effect of different nutriednt types on ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｆ ａ ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ was ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｋｈ２ｐｏ４ ｗａｓ ａ ｎｏｔａｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ affecting ｔｈｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ． ｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｂｉｏｍａｓｓ， ｔｈｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｒ. ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ｆｏｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｕｌｄ raise up ｔｏ ４8．02％ ａｎｄ ７．76％ instead of 32．51％ ａｎｄ ５．９８％ respectively， ｗｈｅｎ the content of ｎｈ４ｃｌ ｗａｓ ０．０５ ｇ／ｌ， ｋｈ２ｐｏ４ ｗａｓ １．４０ ｇ／ｌ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ １．０0 ｇ／ｌ．
ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ； ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ； ｂｉｏｍａｓｓ； ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ of ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
目前，沼泽红假单胞菌被广泛应用于海水、淡水鱼类、虾类及贝类等的养殖和育苗，它能将水体中的有机质和氮磷等物质同化为菌体成分存在于水中，同时消解硫化物［１］，减少水体污染物，减少有毒分解产物［２，３］。沼泽红假单胞菌还能与异养微生物共同作用，高效率地降解废水中的有机物，同时还能调节水体的ｐｈ在适宜的范围内，增加水体中的溶解氧含量［４］。有学者曾对沼泽红假单胞菌的氮磷代谢生理特性进行了研究，相关文献报道沼泽红假单胞菌具有降氮除磷的能力［３，５］，固定化的沼泽红假单胞菌对废水中氮磷的去除率可以分别达到６１．９％和７３．０％［６］。但对于沼泽红假单胞菌同化氮磷适宜条件的研究相关报道较少，而且也不是很全面。为此，对保藏的一株沼泽红假单胞菌的氮磷同化能力在实验室条件下进行了初步研究。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 菌种 沼泽红假单胞菌（ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由华中农业大学生命科学技术学院发酵工程室保藏。
１．１．２ 光合细菌初始培养基 ｎａｃｌ ５．００ ｇ，ｎｈ４ｃｌ １．００ ｇ，酵母抽提物 １．００ ｇ，ｃｈ３ｃｏｏｎａ·３ｈ２ｏ ５．００ ｇ，ｋｈ２ｐｏ４ １．７５ ｇ，ｈ２ｏ １ ０００ ｍl，溶解后调ｐｈ至７．０，高压、１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。试验所用试剂均为分析纯。
１．２ 试验方法
１．２．１ 培养基不同浓度梯度影响试验 配制不同浓度梯度培养基：将初始浓度培养基分别稀释２０、４０、６０、８０和１００倍，调ｐｈ为７．０。以１０％（ｖ／ｖ）的接种量将沼泽红假单胞菌种子液（只含菌体）接入容积为５５０ ｍｌ的带胶塞透明玻璃瓶中，内含稀释培养基５００ ｍｌ，置于２８ ℃恒温培养室中用４０ ｗ白炽灯连续光照培养5 d。每一浓度梯度３个平行，每天取样测定培养基中残留的氮磷量（菌体已滤除）。
１．２．２ 不同营养成分的单因素试验
１）ｎｈ４ｃｌ对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响。将初始培养基中的ｎｈ４ｃｌ分别稀释２０、４０、６０、８０和１００倍，其他组分不变，按照１．２．１的方法进行培养，5 ｄ后测定其ｏｄ６６０nm及ｔｎ、ｔｐ同化率。
２）ｋｈ２ｐｏ４对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响。将ｋｈ２ｐｏ４分别按０．３５、０．７０、１．０５、１．４０和１．７５ ｇ／ｌ添加于培养基中，其他组分不变，按照１．２．１的方法进行培养，5 ｄ后测定其ｏｄ６６０nm及ｔｎ、ｔｐ同化率。
３）酵母抽提物对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响。将酵母抽提物分别按０．６０、０．８０、１．００、１．２０和１．４０ ｇ／ｌ添加于培养基中，其他组分不变，按照１．２．１的方法进行培养，5 ｄ后测定其ｏｄ６６０nm及ｔｎ、ｔｐ同化率。
１．２．３ 不同营养成分的正交试验 在沼泽红假单胞菌生长过程中，直接影响氮磷同化率的因子分别为ｎｈ４ｃｌ、ｋｈ２ｐｏ４和酵母抽提物。为研究ｋｈ２ｐｏ４、酵母抽提物和作为氮源的ｎｈ４ｃｌ对沼泽红假单胞菌生长培养基的综合效应，进行ｌ９（３４）正交试验（表１）。

１．２．４ 验证试验 将沼泽红假单胞菌种子液（只含菌体）以１０％（ｖ／ｖ）接种量分别接入初始培养基和改良后的培养基内，每种培养基做３个平行。２８ ℃下用４０ ｗ白炽灯连续光照培养5 ｄ后，测其ｏｄ６６０nm及ｔｎ、ｔｐ同化率。
２ 结果与分析
２．１ 培养基不同浓度梯度对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响
随着培养时间的延长，沼泽红假单胞菌开始繁殖，初始培养基中的氮磷残留量逐渐下降，5 ｄ时沼泽红假单胞菌吸收氮磷的含量分别为98.73、23.76 mg/l（图1）。随着稀释倍数的不断增加，培养基中残留氮素呈先下降后上升的趋势，拐点出现在接种后第二或第三天，而培养基中磷素变化较小。
试验结果表明，沼泽红假单胞菌首先利用培养基中的氮磷合成自身组分，满足自身生长繁殖需要。随着营养物质逐渐被消耗，菌体之间形成竞争关系而使部分菌体因营养贫乏而死亡，其体内氮磷又释放到培养基中，因此形成培养基残余氮磷浓度先降后升的趋势。
在稀释１００倍时，培养基氮浓度较为接近湖水中的实际情况，其拐点在第二天出现，表现得较为提前，说明该菌株在实际应用过程中，投菌后两天内除氮效率最高。这为如何更加经济地使用沼泽红假单胞菌提出了新的研究思路。

２．２ 单因素试验结果分析
２．２．１ ｎｈ４ｃｌ对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响 随着ｎｈ４ｃｌ稀释倍数的增加，沼泽红假单胞菌的生物量在稀释０～６０倍内变化不大，而在稀释２０倍即浓度为０．０５ ｇ／ｌ时，tn的同化率最高，达到42.08%，tp的同化率也处于一个相对较高值，达到5.11%（图2）。因此，综合考虑选择稀释２０倍即浓度为０．０５ ｇ／ｌ的ｎｈ４ｃｌ较好。

２．２．２ ｋｈ２ｐｏ４对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响 随着ｋｈ２ｐｏ４浓度的增加，沼泽红假单胞菌菌体逐渐增大。当培养基中ｋｈ２ｐｏ４的浓度为１．４０ ｇ／ｌ时，其菌体生长和添加１．７５ ｇ／ｌ ｋｈ２ｐｏ４时无显著差异；当ｋｈ２ｐｏ４浓度为１．０５ ｇ／ｌ和１．４０ ｇ／ｌ时，tn同化率分别达到43.28%和41.74%，tp同化率也达到了6.34%和5.26%（图3）。因此在保证发酵生物量的前提下，选择ｋｈ２ｐｏ４ １．４０ ｇ／ｌ的浓度比较好。
２．２．３ 酵母抽提物对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响 随着酵母抽提物浓度的增加，沼泽红假单胞菌逐渐生长。当培养基中酵母抽提物的浓度为１．０ ｇ／ｌ时，ｔｎ、ｔｐ的同化率最高，分别达到４１．４６％和５．５４％（图4），同时菌体生长与添加１．２和１．４ ｇ／ｌ酵母抽提物时无显著差异。因此，从经济上考虑，选择添加１．０ ｇ／ｌ的酵母抽提物较好。
２．３ 正交试验结果分析
根据以上单因素试验结果选择不同水平合理安排正交试验。通过极差、均值分析，可以得出沼泽红假单胞菌氮磷同化率的最优结果及主要影响条件。从试验结果可以看出，ｂ因素（ｋｈ２ｐｏ４）是影响沼泽红假单胞菌氮磷同化率的主要因素。这可能是由于沼泽红假单胞菌的生长繁殖需要一定浓度的磷元素。沼泽红假单胞菌对磷的同化率较低，因此在分析中以ｔｎ同化率作为主要判断依据，从而选出最优水平组合为ａ２ｂ２ｃ２，即选择ｎｈ４ｃｌ ０．０５ ｇ／ｌ，ｋｈ２ｐｏ４ １．４０ ｇ／ｌ，酵母抽提物１．０ ｇ／ｌ（表2）。
２．４ 验证试验结果分析
经过研究发现，初始条件下培养基中氮磷浓度分别由３０３．６９ ｍｇ／ｌ、３９７．２５ ｍｇ／ｌ下降到２０４．９６ ｍｇ／ｌ、３７３．４９ ｍｇ／ｌ，氮磷同化率分别为３２．５１％和５．９８％。而优化后可以在保证沼泽红假单胞菌发酵生物量的前提下降低氮磷浓度的起始量，培养基中氮磷浓度分别由１１８．６４ ｍｇ／ｌ、３１７．８０ ｍｇ／ｌ下降到６１．６７ ｍｇ／ｌ、２９３．１３ ｍｇ／ｌ，氮磷同化率分别为４８．０２％和７．７６％（图5）。
３ 小结与讨论
在满足最大发酵生物量的情况下，沼泽红假单胞菌生长培养基中的营养成分分别为ｎｈ４ｃｌ ０．０５ ｇ／ｌ、ｋｈ２ｐｏ４ １．４０ ｇ／ｌ、酵母抽提物１．００ ｇ／ｌ时，可以提高该菌对培养基中氮磷的同化效率，其分别达到４8．02％和７．76％。
周茂洪等［３］研究的试验结果表明沼泽红假单胞菌具有一定同化磷的能力，可以将培养基中的无机磷同化为有机磷。在以乙酸钠或苹果酸为碳源的条件下，沼泽红假单胞菌可同化２０ ｍｇ／ｌ左右的磷。试验也证实了这一点，同时还增加了沼泽红假单胞菌对氮素同化能力的研究。
试验中，研究的是沼泽红假单胞菌在培养基中的氮磷转化效率，未涉及到其在实际湖水中的氮磷同化能力。在实际湖水中，其他不同种群微生物的共同作用［７］、藻类的竞争［８］、浮游动物［９］和鱼类的捕食［１０］等都会不同程度地影响沼泽红假单胞菌对氮磷的转化效率，所以应在今后进行进一步探究。
参考文献：
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