血液及骨髓标本的细菌学检验.doc

血液及骨髓标本的细菌学检验一、标本采集（一） 操作方法1将患者拟采血部位放平，扎以止血带，选好静脉穿刺点，以皮点为中心用25 3 碘酊从内向外周擦拭，待干后再以同法用75 乙醇脱碘。消毒范围不得过小。2以无菌手续由静脉取血5 ml ，立即注入适当的液体增菌培养基内， 迅速轻摇，使充分混合，以防止凝固。（二） 注意事项1血液标本应在病人发热1 2 天内或发热高峰采集培养为宜，此时阳性率较高。2培养基与血液的比例为101 。3培养一般细菌用普通肉汤或酚红葡萄糖肉汤，培养对营养要求较高的细菌用肝浸液或胰胨肉汤等。4采血和接种时应严格注意无菌操作，避免污染杂菌。5磺胺和抗生素可影响细菌检出的结果。故在采集标本时应力争在抗菌药物治疗之前。如果病人曾服用磺胺类药物，应在每100 ml 培养基内加对氨苯甲酸5 mg ， 以防止磺胺类药物对细菌的抑制作用。如果病人已用青霉素治疗，应在培养基中加入青霉素酶100 U50 ml （青霉素酶不耐热，应在临用时加入）。若病人已用其他抗生素治疗时，可用硫酸镁肉汤增菌。6标本的采取应以提高阳性检出率为目的。二、检验程序血液标本的细菌学检验程序见下图。三、检验方法及报告方式（一） 一般细菌的检验1标本接种于肉汤培养基后，立即置35 1 温箱内孵育，每天取出一次观察有无细菌生长，应特别注意观察肉汤内有无混浊、沉淀、菌膜、色素、血液变色、指示剂变色等现象，并记录之。如有细菌生长，肉汤可呈现各种不同的生长现象，若发生混浊，大多可疑为革兰阴性杆菌；若均匀混浊有绿色荧光，则可疑为绿脓杆菌；上面澄清，下面有沉淀，可疑为链球菌；若见自下而上的溶血现象，可疑为溶血性链球菌；若呈现肉冻样凝固现象，疑为葡萄球菌；若表面有灰白菌膜，疑为枯草杆菌或类白喉杆菌。2当疑有细菌生长时，应以无菌操作挑取培养物涂片进行革兰染色镜检。一旦见有细菌生长，并能排除污染，应及时转种于血平板或其他培养基进行药物敏感试验或分离培养。根据菌落特征及菌体染色镜检形态，可得出初步印象，并需继续培养，按各种属细菌加以鉴定。报告：“有X X X 菌生长”。3如不见细菌生长，应继续培养至第7 天，取出后接种于血平板，经培养仍无细菌生长时，可报告为：“经7 天培养无细菌生长。” 对于亚急性心内膜炎病人标本，应培养一个月，才能作出结论。（二）布氏杆菌的检验将可疑为布氏杆菌的血液标本接种于肝浸液2 支，分别置于10 二氧化碳环境中及普通环境中35 1 培养，每天观察一次，每隔5 天移种一次血平板。培养1 周后，若肝浸液有此菌生长时，出现肉眼可见的轻度混浊，久之可出现菌膜并有粘稠性沉淀物。此时应作涂片染色镜检，并立即移种于2 份肝浸液平板或血平板，分别置于10 二氧化碳及普通环境下培养。如菌落及涂片染色镜检形态典型，再作布氏杆菌血清凝集试验，如为阳性，可报告为：“培养出布氏杆菌”。必要时，可将分离的菌株进一步鉴定及分型。若培养3 4 周后仍无细菌生长者，则可报告：“经X 周培养无细菌生长。”（三）脑膜炎奈瑟菌培养首先将胰胨肉汤或含2gL 葡萄糖的肝浸液（或肉浸液） 预温至35 ，然后再将病人的血液标本注入培养基瓶中，摇匀后培养于10 二氧化碳环境中， 每天观察一次。如疑有细菌生长，再移种于经35 预温的巧克力色血平板或血平板进行划线分离，然后于35 1 、5 10 二氧化碳环境中培养18 48 小时， 如发现平板上有光滑、湿润、透明、粘性的菌落且中等大小，经革兰染色为阴性双球菌者， 可做出初步报告：“有脑膜炎奈瑟菌生长。” 同时挑取菌落接种于预温的巧克力色或血平板同上法行纯培养。经涂片染色镜检确定后，作糖发酵、氧化酶、自凝现象，血清玻片凝集等试验，以与其他奈瑟菌区别。如各项检查均符合此菌者，必要时再用分群血清作玻片凝集进行分群作出最后鉴定。（四） 伤寒沙门菌及其它沙门菌培养将病人的血液接种于葡萄糖胆汁肉汤或胆盐肉汤中，经增菌培养后，如疑有细菌生长，再移种到选择性平板（如SS 琼脂平板，中国蓝平板等） 上作划线分离， 置35 1 培养16 24 小时后，挑取可疑菌落接种于双糖或三糖铁高层斜面培养基， 观察其生化反应。根据生化反应，可初步区别细菌类属。再与多价诊断血清作凝集试验，即可作出初检报告。必要时，用纯培养物进一步作生化反应和选用适当的因子血清作凝集试验，加以鉴定，即可确诊。若无细菌生长，培养至第7 天即可报告：“培养7 天无细菌生长”。（五） 厌氧菌培养将血液标本接种于肝浸汤培养基中，然后置厌氧环境中培养。如有细菌生长，移种两个血平板或K V A 血平板（或LK V 、苯乙醇血平板） 上，分别作厌氧培养和普通培养，经35 1 48 72 小时培养后，观察结果。如在普通环境中培养不生长，而在厌氧环境中生长，观察其生长情况，并作涂片进行革兰染色镜检。根据形态，得出初步印象，然后对分离出的厌氧菌进行最后鉴定。并作出报告：“厌氧培养有X X 菌生长。” 如仅在普通环境中生长或者两者均生长，则按一般细菌进行鉴定。如无细菌生长，应继续培养7天，仍无细菌生长时，即可报告：“厌氧培养7 天无细菌生长”。四、临床意义及常见病原菌目前，血液培养仍然是菌血症和败血症的细菌学检验的基本方法，并且广泛地应用于伤寒、副伤寒及其他革兰阴性杆菌和各种化脓性细菌引起的败血症的诊断。菌血症系病原菌只一时性或间断地由局部进入血流，但并不在血中繁殖者，无血液受染的明显临床征象。常可发生在病灶感染或牙齿感染，尤以拔牙、扁桃体切除及脊髓炎手术后等多见。败血症是指病原菌侵入血流，并在其中大量生长繁殖，造成身体的严重损害，引起显著的全身症状（如不规则高热与全身中毒等症状）。例如化脓链球菌和葡萄球菌所致的手术后败血症，常可造成某处组织器官的败血性栓塞而形成局部感染性病变。败血症有时也可见于继发于组织器官感染，当机体抵抗力减弱时，虽然微小甚至隐蔽的病灶亦能引起败血症。从理论意义看任何病原菌都可引起败血症。在临床实践中，首先与地区性流行病、原发病灶和细菌的侵入途径有关。例如疖、脓肿、痈和胃肠道粘膜炎及尿路感染等。其次当机体免疫功能低下、广谱抗生素和激素的应用及烧伤等都可有不同的菌类的感染。一般说，最常见者有葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、链球菌、伤寒和副伤寒沙门菌等。大肠杆菌、粪产碱杆菌、肺炎克雷伯菌及粘球菌属等其它革兰阴性杆菌，以及炭疽杆菌和厌氧杆菌亦可见到。另外，绿脓杆菌和真菌性败血症日益增加，这与抗生素广泛应用有关，其原发病变多见于皮肤感染（包括烧伤）、尿路感染、消化系感染、血液病及麻疹肺炎等。目前L 型菌感染败血症亦有报告，主要是由于使用抑制菌细胞壁合成的抗菌药物（青霉素G 、氨基苄青霉素、苯唑青霉素、先锋霉素、万古霉素和环丝霉素等）治疗过程中，失去细胞壁的菌体继续繁殖感染所致。血培养中常见病原菌见下表。