LS-50荧光分光光度计操作手册.doc

ＬＳ－４５／５５ 荧光／磷光／发光
分光光度计

使用说明书

美国Perkin Elmer公司
王国强 黄建权编译
２００２年４月

一、理论基础

荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下：
室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”
每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。

图 １ 荧光的能级图

１、 荧光的产生
当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。
２、 磷光的产生
从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。
由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。

图 ２ 磷光的能级图

３、 化学发光及生物发光的产生
某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。

二、仪器简介
１、 仪器原理
图 ３ ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图

用于测量荧光／磷光／发光的ＬＳ４５／５５是由图３所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。
由光源发出的光经激发光单色器得到所需要的激发光波长。如其强度为Ｉ０ ，通过样品池后，由于一部分光能被荧光物质吸收，其透射光强度减为Ｉｔ 。荧光物质被激发后，将发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向进行。为了消除可能共存的其他光纤的干扰，如由激发光所产生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及为将溶液中的杂质所发生的荧光滤去，以获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了发光单色器，荧光作用于检测器上，得到了相应的电信号，经放大后再记录下来。
（１）激发光源：在紫外－可见区范围内，氙灯最为常用，而又分连续和脉冲氙灯。ＬＳ４５／５５采用的是脉冲氙灯。二者比较如下：
所以采用脉冲氙灯的ＬＳ４５／５５不需附件，可直接测定荧光、磷光及发光。
（２）样品池：荧光用的样品池需用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（３）激发单色器：用于选择激发波长。
（４）发射单色器：用于分离出荧光／磷光／发光的发射波长。
（５）检测器：荧光的强度通常比较弱，因此应采用具有较高灵敏度的光电倍增管，并与激发光成直角。
ＬＳ４５／ＬＳ５５的标准检测器检测下限为６５０ｎｍ，若要测到９００ｎｍ则应选择红敏倍增管。

三、软件应用
（一）、仪器状态菜单的应用

图 ４ 仪器状态（Ｓｔａｔｕｓ）菜单

在仪器状态（Ｓｔａｔｕｓ）菜单（见图４）中的应用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）项下的下拉菜单中的ＬＳ－５５ Ｓｔａｔｕｓ中点击，则出现图５的菜单。
图 ５ 仪器状态菜单

此菜单中的各部分，均为动态对话框。点击其中任何部分均可进入下一级菜单，通过参数上的设置，直接用软件控制仪器。
如点击左上角的光源部分（Ｓｏｕｒｃｅ），随即出现图６的菜单：可实现光源的开关、及荧光、磷光和发光测定模式的选择。
１、荧光测定模式的设置

图 ６ 荧光测定模式的设定

在红色的“Luminescence Mode”中“fluor（荧光）”，即可选定荧光测定模式。通过点击右上角的红色数字“１（氙灯开）”或“０（氙灯关）”，即可控制光源的开关。
２、 磷光测定的设置
在红色的“Luminescence Mode”中“phos（磷光）”，即可选定荧光测定模式（图7）
图 ７ 磷光测定模式的设定

图７在磷光测定模式下样品受脉冲氙灯光源激发后的测定条件。氙灯每闪亮一次所产生的能带峰其带宽不超过１０ｕｓ。在此期间，受激样品所产生的磷光达到最大强度值Ｉ０，然后按指数曲线衰减直至消失。样品光电倍管要等延迟一段时间（ｔｄ）后才开启，所以不会与光源的闪亮时间重合，门限时间（ｔｇ）──测量时间与延迟时间（ｔｄ）均可调节，最小调整步距为0.01ms如选择的延迟时间大于0.1ms，就不会测量到荧光信号。每个测定周期可以大于一次闪亮。例如：设闪亮次数为３，则在每一个测定周期中有３ 次闪亮及其后的延迟时间和门开时间。所设的周期时间 (Cycle Time)应≥（闪亮数×电源频率周期）＋ｔｇ+ｔｄ-12.99ms。如ｔｇ+ｔｄ值大于12.99ms，周期时间应设至大于一个电源周期。闪亮频率及电源的周波（在中国为50Hz），所以每次闪亮即电源的一个周期（在中国为20ms）。
在磷光的测定模式中，暗电流是在开始测定后自动在２０个数据收集周期中进行测定的，暗电流信号被储存并在该设定波长下测定的样品信号中被减去。每当改变门限时间时，自动重新测定暗电流。
各参数范围如下表：
参 数
范 围
步 距
延迟时间(Delay Time, ｔｄ)
0 ～9000ms
0.01ms
门限时间(Gate Time, ｔg)
0.01 ～500ms
0.01ms
周期时间(Cycle Time)
1～ 9999ms
一个电源周期(ms)
闪亮次数(Flash)
1～ 10
1
注：周期时间 (Cycle Time)应≥（闪亮数×电源频率周期）＋ｔｇ+ｔｄ-12.99ms。如ｔｇ+ｔｄ值大于12.99ms，则周期时间应设至大于一个电源周期。

３、发光（化学、生物）发光测定的设置
在红色的“Luminescence Mode”中“biolum（发光）”，即可选定发光测定模式（图８）。
图 ８ 发光测定模式的设定
当测定化学或生物发光时，应将光源灯关闭，只有样品光电倍增管接受数据信号，积分时间与磷光测定时一致。暗电流则自动测定２０次（每隔２０ｍｓ测一次），数据储存并自动从样品测定数据中减去。每当门限时间改变后，都会自动重测暗电流。

（二）扫描（Ｓｃａｎ）菜单的应用
１、扫描的三种方式
１．１ 预扫描：以便找出未知样品的最适宜激发波长；
１．２ 单个单色器扫描：可单独进行激发光或发射光的光谱扫描；
１．３ 同步扫描：两个单色器以一定的波长间距同步转动进行扫描；
２、 预扫描
２． １激发光单色器预扫描（发射光单色器固定在某波长）
２． ２发射光单色器预扫描（激发光单色器固定在某波长）
２．３激发／发射预扫描（自动顺序进行上述两种预扫描）

图 ９激发／发射预扫描菜单

在相应的对话小框中分别键入激发光和发射光的起止波长。在狭缝小框中分别键入激发光和发射光的宽度。

３、 激发或发射光谱的扫描
３．１ 激发光谱的扫描

图１０ 激发光谱的扫描

３．２ 发射谱的扫描
图１１ 发射光谱的扫描菜单

点击图中Ex.Momo或Em.Mono的单色器图标，则可得到下图：

图１３ 激发或发射单色器的设置菜单

点击图１３中的“Emission Filter”中下拉箭头，即可出现一下拉菜单，可选择在光路中加入一定波长下的截止滤光片以消除倍频峰，还可选择“1% Attenuator”即１％的透过衰减片，以降低过强的荧光强度。

４、 同步扫描
同步扫描有助于一些有机化合物的判别，特别是复杂的混合物物，如粗油。同步扫描又分为“固定波长差”或“固定能量差”这两种形式。
图１２ 固定波长差的同步扫描模式
即激发光与发射光保持２５ｎｍ的间距同步扫描
图１３ 固定能量差的同步扫描模式
即两单色器的频率差（能量差）为３０００
４、 时间驱动模式
图 １４ 时间驱动模式的菜单

时间驱动模式可供在固定波长上记录一定时间内的样品荧光强度变化。图１４的菜单中“Durations(s)”为所要测定的总时间（秒），“Data Interval(s)”为每两个测量点间的时间（秒）。
５、强度／浓度模式（Ｒｅａｄ）
图 １５强度／浓度模式（Ｒｅａｄ）菜单
自动测浓度的步骤：
５．１ 将所含已知浓度的样品标准溶液放入样品室；
５．２ 确认所需的波长及狭缝均已设好；
５．３ 选定Ａｕｔｏｃｏｃｎ行，并在下面的小框中键入该标准溶液的浓度值；
５．４ 键入所需的信号积分时间；
５．５ 单击Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，标准溶液的荧光强度值会显示在其右边的小框中，此值自动被刚输入的浓度值所除，得到其商Ｋ并暂存，只要一直选定Ａｕｔｏｃｏｃｎ行，以后的样品测定所得的荧光强度会自动乘上Ｋ值而成为浓度值显示。

６、 波长编程扫描模式（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍ）
图 １６ 波长编程扫描模式（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍ）菜单

波长编程扫描可在一系列不同的激发和发射波长下来测定样品的荧光强度。

７、 用标准曲线法测定浓度的模式
图 １７ 仪器应用选项菜单

在图１７中选择“Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（浓度）”项，即可出现下图：
图 １８ 浓度测定模式仪器条件设置菜单
设定激发波长、最大发射波长及激发与发射狭缝等条件后，点击“Refrence”项，即可出现下图：
图 １９浓度测定模式标准样品条件设置菜单

在图１９的对话框中输入一系列标准样品所对应的浓度及并测量相应的荧光强度值，即可回归出相应的一元或多元的回归方程。点击“Ｓａｍｐｌｅ”项，即可得到下图：
图 ２０浓度测定模式待测样品条件设置菜单
在图２０中输入相应的数据后，点击“Ｖｉｅｗ Ｒｅｓｕｌｔｓ＂项，即可得到下图：

图 ２１浓度测定模式待测样品结果

图２１显示了待测样品的浓度。