淡豆豉、黑大豆和黄大豆中多糖含量研究.doc

淡豆豉、黑大豆和黄大豆中多糖含量研究*
葛喜珍1, 张静1，2，林强1，田平芳2
（1．北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023；
2．北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）

摘要：目的：比较三种淡豆豉、黑大豆和黄大豆中多糖含量。方法：采用超声方法平行提取淡豆豉、黄大豆和黑大豆中的多糖类成分，并通过硫酸-苯酚显色，使用紫外分光光度法进行检测。结果表明，淡豆豉、黑大豆和黄大豆中多糖含量分别为0.91%、0.14%和0.23%。结论：淡豆豉中多糖含量明显多于黄大豆和黑大豆。
关键词：淡豆豉；黑大豆；黄大豆；超声提取；多糖含量

Study on Contents of Polysaccharides from Semen Sojae Preparatum, Black Soybean and Yellow Soybean

GE Xi-zhen1, ZHANG Jing1,2, LIN qiang1, TIAN Ping-fang2**
(1. Biochemical Engineering College, Beijing Union University, Beijing 100023, China;
2. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)
Abstract: objective: Compare of contents of polysaccharides from Semen Sojae Preparatum, black soybean and yellow soybean. Method: Polysaccharides were extracted using ultrasonic from the raw material of Semen Sojae Preparatum, black soybean and yellow soybean. The total contents of polysaccharides were detected with UV spectrophotometer after coloration by the method of sulphuric acid and phenylic alcohol. Results: the contents of polysaccharides from Semen Sojae Preparatum, black soybean and yellow soybean were 0.91%、0.14% and 0.23%, respectively. Conclusion: Semen Sojae Preparatum had the highest contents of polysaccharides.
Key words: Semen sojae preparatum; black soybean; yellow soybean; polysaccharides contents; ultrasonic extracting

*基金项目：北京市教育委员会科技发展计划资助项目（KM200611417013）；北京市人才引进计划项目。
通讯联系人：葛喜珍，博士，副教授，研究方向为中药对糖尿病的防治。北京朝阳区垡头西里三区18号北京联合大学生物化学工程学院生物医药系 100023
E-mail：gexizhen@ tel：[phone]
作者简介:葛喜珍(1968 ),女(汉族),河北平山人,现为北京联合大学副教授,博士学位,主要从事中药对糖尿病的防治研究.

大量研究证明，大豆具有良好的保健作用，大豆种类很多[1]，包括黑大豆、黄大豆、青大豆等。传统中药淡豆豉为黑大豆成熟的种子与桑叶、青蒿等中药辅料发酵而成，功可解热除烦，大豆的化学成分复杂，包括蛋白质、多肽、维生素、酶、氨基酸、皂苷、花色苷、异黄酮、多糖等[2]，其中多糖已成为现代研究的热点，大豆发酵后多糖成分是否有变化？此方面的研究尚未见报道。依据多糖类的性质，本研究以淡豆豉、黑大豆和黄大豆为原料，平行提取并检测其中的豆豉多糖、黄豆多糖和黑豆多糖，为研究和比较淡豆豉、黑大豆和黄大豆提供理论基础。
1. 材料
1.1 药品与试剂
淡豆豉、黄大豆、黑大豆（均购自河北安国）；胃蛋白酶（活性 1:12000）；葡萄糖（批号：030422）；乙醇、石油醚、浓硫酸、苯酚等均为分析纯。
1.2 实验仪器
TU-1810PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-3000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-95B型循环水式多用真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）；6002型高速粉碎机；METTLER AE100电子分析天平；恒温水浴箱。
2. 方法
2.1 提取路线
准确称量石油醚脱脂（料液比 1：5）后的淡豆豉、黄大豆和黑大豆原料各20g，80%乙醇温浸24h，超声提取醇溶性组分，过滤。称量滤饼重量，将其溶于10倍体积的蒸馏水中，超声提取多糖组分，料液比：1：10，提取温度：70。C，提取时间40min/次，3次。过滤，将滤液挥干溶剂至一定体积，合并提取液，得到粗多糖浓缩液。
2.2 粗多糖浸提液的精制
蛋白质的去除：采用胃蛋白酶水解粗提液中的水溶性杂蛋白，蛋白酶用量3%（质量分数），依据此种蛋白酶的性质，水解条件采用 PH=7.0，恒温水浴60。C，水解1h。水解结束后水浴升温至90。C，维持6min使酶失活，终止酶反应。
蛋白多肽的去除：使用5倍量的80%乙醇，在50。C下、30min提取蛋白质水解所产生的蛋白多肽，提取后温浸过夜。次日将样品以4500r/min的离心速度，离心10min，使多糖充分沉淀。最后，用1.5%（体积分数）的活性炭吸附多糖中少量小分子杂质和进行脱色处理，过滤，即得到精制后的豆豉、大豆多糖样品。
2.3 紫外分光光度法检测多糖样品含量
2.3.1葡萄糖标准溶液的配制
准确称取105。C下干燥至恒重的葡萄糖标准品50mg，蒸馏水定容至100ml容量瓶得到0. 5mg/ml的葡萄糖标准储备液。分别吸取0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml于五支刻度试管中，蒸馏水分别定容至10ml。得到线性范围为5μg/ml～30μg/ml的葡萄糖标准浓度梯度溶液。
2.3.2 硫酸苯酚法
硫酸苯酚法的显色原理是多糖类在硫酸作用下，先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合，己糖缩合物呈橙黄色溶液，在490nm处有特殊吸收。
标准溶液的显色处理：分别取以上各浓度梯度的标准溶液2ml于五支刻度试管中，各加入5%苯酚溶液1ml，充分振荡，迅速添加浓硫酸5ml并摇匀。置于40。C恒温水浴箱中保温30min取出，放入冷水浴中冷却约15min，至室温。此时原本无色的葡萄糖标准溶液呈现均匀透明的橙黄色，以第一个浓度梯度的标准溶液为空白溶液，紫外分光光度计进行检测。
2.3.3 扫描多糖样品的最大吸收波长
将由淡豆豉、黄大豆和黑大豆中提取得到的多糖浓缩液分别用蒸馏水定容至200ml，得到三种多糖样品溶液。
各移取1ml，稀释至20ml，并从中吸取2ml，加入硫酸苯酚按标准溶液显色项操作，使其均匀显色。紫外分光光度计扫描最大吸收波长（见图1），可见样品最大吸收波长分别为488、487和488nm，与葡萄糖标准溶液基本一致（490nm），故在490nm处制备标准方程并对样品进行检测。

Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of polysaccharides sample
1 Semen sojae preparatum 2 yellow soybean 3 black soybean
3 结果与讨论
3.1 标准方程
在490nm波长处测定一系列葡萄糖标准溶液的吸光度值，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，得到标准曲线方程：A=0.0161C+0.1288，相关系数R2=1.0000。证明葡萄糖在5μg/ml～30μg/ml的浓度范围内呈良好线性关系。（见图2）

Fig.2 Standard curve of glucose
3.2 多糖样品的检测
将检测得到的三种多糖样品的吸光度值代入标准方程，换算成浓度，并依据其稀释倍数换算得到淡豆豉、黄大豆以及黑大豆中多糖组分的含量（见表1, 图3）。
其中，定义 多糖的含量（g/g）=多糖量∕（脱脂原料的质量）×100%

Tab 1 Contents of polysaccharides in three different raw materials

图3 不同原料多糖组分含量比较图
Fig.3 Contents Comparison of polysaccharides in three different raw materials
3.3 精密度实验
3.3.1 标准品精密度实验
取葡萄糖标准储备液各0.6ml于5支刻度试管中，分别用蒸馏水定容至10ml，显色后检测其吸光度分别为0.611、0.612、0.592、0.594、0.610，相对标准偏差RSD=1.64%。
3.3.2 样品精密度实验
精密移取黄豆多糖样品溶液1ml，分别置于五支10ml刻度试管中定容，硫酸苯酚法显色，检测其吸光度分别为0.469、0.470、0.477、0.473、0.476，计算其RSD=0.75%。
以上标准品和样品精密度实验结果表明，本实验仪器及检测方法重现性和稳定性好，检测结果准确性及可信度高。
3.4 稳定性实验
3.4.1标准品稳定性实验
取一定浓度的葡萄糖标准溶液，分别于室温0、1、2、4、6h时检测其吸光度。
3.4.2 样品稳定性实验
取黑豆多糖样品溶液1ml，蒸馏水定容至10ml。分别于室温0、1、2、4、6h时检测其吸光度。检测结果见表2。
Tab 2 Results of stability experiment

因此，实验表明标准溶液及多糖样品溶液在6h内稳定。
3.5 加样回收实验
取三支刻度试管，分别精密吸取黑豆多糖样品溶液0.5ml，各添加0.5mg/ml葡萄糖标准储备液0.05ml、0.1ml、0.2ml，制成低、中、高三种浓度，蒸馏水定容，显色后检测吸光度值，结果见表3。
Tab 3 Results of recovery experiment

4讨论
本实验采用酶法除蛋白，避免了其他杂质的引入，且多糖损失率低。实验结果表明，三种原料中多糖的含量依次为：淡豆豉＞黄大豆＞黑大豆。中药淡豆豉具有较高的生理活性，其含有的豆豉多糖是其重要组分之一。并且诸多文献表明大豆同样具有防治糖尿病的疗效，然而大豆多糖是否起到主要作用，值得进一步研究和探讨。本实验采用超声提取工艺，操作简单、省时，提取率高。为今后豆豉多糖、大豆多糖的进一步研究奠定了基础。
REFERENCES：
[1] Faraj Abdul, Thava Vasanthan, Abdul. Soybean Isoflavones: Effects of Processing and Health Benefits [J]. Food Reviews International, 2004, 20(1):51-75.
[2] Ngai Patrick H. K.，Ng, T. B. Purification of glysojanin, an antifungal protein, from the black soybean Glycine soja. Biochemistry & Cell Biology[J]. 2003, 81（6）：387-394.

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