太空香蕉‘天成1号’枯萎病菌的分离鉴定.pdf

接收日期：2023-03-08 接受日期：2023-05-15 基金项目：厦门市社会科技指导项目(No.3502Z20199001)*通信作者。E-mail: 太空香蕉天成太空香蕉天成 1 号枯萎病菌的分离鉴定号枯萎病菌的分离鉴定 卢丽俐1，林文珍2，王金英1，郭 莺2，蔡长福1，蔡邦平1*(1.厦门市园林植物园，福建 厦门 361003；2.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)摘 要：天成 1 号香蕉 Musa paradisiaca Tiancheng No.1是利用巴西蕉通过航天育种选育的香蕉新品种，在区域种植试验中出现植株枯萎症状。取其枯萎病植株组织，经分离、纯化、培养病原菌，并将病原菌灌根回接蕉苗进行致病性测定，同时结合形态学特征和 rDNA-ITS 序列检测的方法鉴定病原菌类型。根据形态特征鉴定天成 1 号枯萎病病原菌株 LWZ-XJ-4 为尖孢镰刀菌，基于 rDNA-ITS 序列构建的系统发育树显示该病原菌与尖孢镰刀菌古巴专化型 4号生理小种进化距离最近。研究结果明确了引起太空香蕉天成 1 号枯萎病的病原菌类型，对该香蕉品种枯萎病防控及推广种植有重要意义。关键词：香蕉枯萎病；尖孢镰刀菌古巴专化型；形态特征；ITS 序列 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2023.03.012 中图分类号：S668.1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2023)03-0265-06 Isolation and Identification of Fusarium oxysporum Causing Wilt of Musa Tiancheng No.1 LU Li-li1,LIN Wen-zhen2,WANG Jin-ying1,GUO Ying2,CAI Chang-fu1,CAI Bang-ping1*(1.Xiamen Botanical Garden,Xiamen 361003,Fujian China;2.Fujian Institute of Subtropical Botany/Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plants,Xiamen 361006,Fujian China)Abstract:The symptoms of plant wilt were found in the regional planting test of Musa paradisiaca Tiancheng No.1,which is a new banana variety developed through space breeding using Baxijiao.In this study,samples were taken from the typical plants of Tiancheng No.1 with fusarium wilt.The pathogenic fungus was isolated and purified by tissue isolation method,and then the pathogenicity test was conducted by inoculating the roots of Tiancheng No.1 seedlings.At the same time,the pathogen were identified by combining morphological characteristics and rDNA-ITS sequence detection.The results showed that the pathogenic strain LWZ-XJ-4 was identified as F.oxysporum according to its morphological characteristics.The phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence showed that the pathogen closed to physiological race 4 of F.oxysporum Cuban specialization.The study identified the type of pathogen causing the wilt of banana Tiancheng No.1.The results were suggestive to the control of the fusarium wilt and the promotion of Tiancheng No.1.Key words:fusarium wilt of banana;Fusarium oxysporum f.sp.cubense;morphological characteristics;ITS sequence 香蕉Musa paradisiaca是世界上最重要的水果之一，也是发展中国家最重要的四大作物之一1。我国是香蕉生产大国，也是重要的消费大国2。然而，世界各地香蕉产业正受到各类病害的威胁，其 2023,52(3):265270.Subtropical Plant Science 第 52 卷 266中由古巴尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc)引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害35，给香蕉生产造成重大损失。目前，已鉴定的尖孢镰刀菌萎蔫专化型生理小种有8个，其中4个可以引起香蕉枯萎病68。这4个生理小种危害的香蕉品种各不相同，Foc1号生理小种主要侵染大蜜哈(Gros Michel，AAA)，全世界都有发生；Foc2号生理小种仅局限在中美洲，只侵染三倍体杂种棱香蕉(Bluggoe,ABB)和其他相近的煮食香蕉；Foc3号生理小种只侵染羯尾蕉属Heliconia的野生种；Foc4号生理小种不仅侵染矮秆香芽蕉(Dwarf Cavendish，AAA)，还侵染所有对Foc1号和Foc2号生理小种感病的品种，是目前致病力最强的病菌5,9。在我国普遍存在的香蕉枯萎病致病菌多为Foc1和Foc4 1011。因此，香蕉枯萎病的防控及抗病育种已成为香蕉生产的研究热点1213，对香蕉产业的持续健康发展具有重要意义。本研究的香蕉品种为自主选育的太空诱变新品种天成1号M.paradisiaca Tiancheng No.1(Musa AAA Cavendish subgroup)。该品种是利用巴西蕉M.paradisiaca Baxijiao为材料，于2002年搭载“神舟4号飞船”，经外太空辐射诱变而获得的，具有高产、早熟、抗逆性强、耐贮存等优点，目前在福建东南沿海的漳州、厦门、莆田等地区进行区域种植试验。在区域试验过程中，在漳州部分地区发现有天成1号枯萎植株，其症状与镰刀菌枯萎病相似。本实验利用分子检测技术对分离的病原菌进行鉴定，以期明确该品种枯萎病病原菌，为天成1号推广种植的枯萎病防控提供重要的基础资料，也为香蕉枯萎病的抗病种质资源筛选提供科学依据。1 材料与方法 1.1 材料 于2022年78月从漳州天宝香蕉种植基地采集香蕉天成1号典型发病植株，用于病菌分离(图1)。由福建省林业科技中心提供的香蕉天成1号组培无菌苗用于病菌致病性测定。组培苗用无菌盆土培养，待长出45片叶、株高1216 cm时接种病菌。1.2 方法 1.2.1 病菌分离纯化病菌分离纯化 用常规的组织分离法分离香蕉天成1号枯萎病病原菌14。将发病植株假茎基部作为分离材料，在病健交界处切取0.5 cm 0.5 cm小块组织，先用0.1%升汞消毒35 min，再用75%乙醇消毒3550 s，之后用无菌水冲洗3次，把病菌组织放入PDA培养基中暗培养34 d。挑取病菌组织上产生的霉状物进行纯化培养。观察菌株生长性状，在显微镜下观察菌株形态特征。1.2.2 致病性测定致病性测定 采用灌根接种法将分离纯化的病原菌回接蕉苗1516。菌株在PDA液体培养基中，28，170 rmin1，震荡培养5 d，无菌纱布过滤培养液。将制备好的病原菌孢子悬液浇施在有伤根的香蕉天成1号幼苗种植土壤中，每盆1株，3次重复。每盆浇施量50 mL，无菌水作空白对照。香蕉苗置于26 人工气候培养箱中光照培养。从接种后第5天开始观察发病情况，并从病株上重新分离病原菌。1.2.3 病原菌菌株鉴定病原菌菌株鉴定 将纯化的菌株接种至PDA培养基，28 恒温、避光培养45 d，观察菌落形态特征，对病原菌株进行形态学鉴定1718。图 1 太空香蕉天成 1 号枯萎病病株 Fig.1 Fusarium wilt of banana Tiancheng No.1 采用全式金的EasyPure Genomic DNA Kit方法提取菌株的菌丝体DNA，扩增ITS序列，扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序1920。测第 3 期 卢丽俐等：太空香蕉天成 1 号枯萎病菌的分离鉴定 267序结果通过NCBI进行BLAST比对分析，并从NCBI上下载同源性较高的碱基序列，用软件MEGA11构建系统发育树，以确定病原菌株的分类地位。2 结果与分析 2.1 病原菌株的形态特征 从香蕉天成 1 号枯萎病病株上分离得到一株病原菌 LWZ-XJ-4，在 PDA 上纯化培养，菌落圆形，培养 4 d，菌落直径 5.5 cm。气生菌丝绒状、白色、纤细浓密，培养基底面呈红色或紫红色(图 2A)，能产生分生孢子。镜检发现，分生孢子较多(图 2B)，含质体，略透明，大型分生孢子数量最多，镰刀形，两头稍尖，稍弯，有 3 至多个隔膜，一般为 3 个隔 膜，长 30.154.1 m 3.64.0 m，小型分生孢子多为椭圆形、无隔，长 9.516.6 m 2.54.0 m。厚垣孢子为透明状球形(图 2C)，单生，直径 1.79.5 m。根据菌落形态和显微镜镜检结果，初步确定该病原菌为尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum。2.2 接种蕉苗发病症状 人工灌根接种病菌5 d后，蕉苗开始出现黄叶症状。随着时间的推移，蕉苗发病症状更严重，25 d后蕉苗基本枯萎死亡。发病初期，香蕉叶片边缘变黄，逐渐扩展至主脉。病叶由下至上、由外至里出现黄色斑块、萎蔫，最后整株枯萎死亡(图3)。剖开蕉苗球茎发现，球茎组织已全部变黑、腐烂，假茎组织可见红色斑点和线条状病变(图3)，根黑褐色，图 2 病原菌菌落形态及显微特征 Fig.2 Colony morphology and microscopic characteristics of pathogenic bacteria A.病原菌菌落形态；B.大孢子和小孢子(400)；C.菌丝和厚垣孢子(400)图 3 灌根接种蕉苗 25 d 后发病情况 Fig.3 Symptoms of banana Tiancheng No.1 after 25 d artificial inoculation 左：植株情况；中：球茎横剖面；右：假茎纵剖面 A.对照；B.接种菌株 LWZ-XJ-4 的蕉苗 第 52 卷 268基部腐烂，植株易倒伏。接种病原菌蕉苗植株生长不良、矮小、萎蔫，心叶抽不出，生长停滞枯萎。对照植株未出现任何病症，长势健壮良好。2.3 病原菌株的分子鉴定 对病原菌菌株LWZ-XJ-4的ITS序列进行扩增，测得碱基序列(图4)，序列长573 bp。对病原菌株的测序结果在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，菌株LWZ-XJ-4与尖孢镰刀菌属序列同源性90%，利用软件MEGA11构建以尖孢镰刀菌rDNA-ITS序列为基础的系统进化树(图5)，发现菌株LWZ-XJ-4与尖 图 4 菌株 LWZ-XJ-4 的 rDNA-ITS 序列 Fig.4 rDNA-ITS sequence of strain LWZ-XJ-4 图 5 基于 rDNA-ITS 序列构建的菌株 LWZ-XJ-4 系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree constructed by strain LWZ-XJ-4 based on rDNA-ITS sequence 第 3 期 卢丽俐等：太空香蕉天成 1 号枯萎病菌的分离鉴定 269孢镰刀菌香蕉转化型菌株Fusarium oxysporum，LT571434.1的进化距离最近。对发病植株再次组织分离获得的病原菌，其病原形态特征与接种病原菌形态完全一致。根据菌落形态、致病性测定结果和结合田间症状，最终确定引起太空香蕉天成1号枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum；经分子检测，该病原菌与尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 4 进化距离最近。3 讨论 香蕉枯萎病是一种传染性较强的国际检疫性病害，对全球香蕉产业造成了巨大的损失21。在我国香蕉主产区枯萎病的发病情况也十分严重，不仅直接影响香蕉产量，而且迫使蕉农频繁地换地种植，从而造成生产资料和土地资源浪费，导致种植成本居高不下22。目前在病区除了种植抗病品种，尚无十分有效的防治措施23，因此选育和种植抗病品种是防控香蕉枯萎病的主要途径24。近年来，我国通过杂交育种25、突变育种2、生物技术育种等手段开展香蕉抗病品种的研究工作，并取得一些成果,先后培育出多个抗(耐)病品种，如广东省农科院选育的粤科1号粉杂1号中蕉9号等1213,2526。在国外，Bhagwat等28利用咖吗射线培养香蕉外植体后发现，部分组培苗表现出一定的抗病性。印度研究人员通过香蕉悬浮细胞辐射诱变获得抗香蕉枯萎病1号生理小种的抗病系“Maca”29。太空香蕉天成1号是经过外太空辐射选育的新品种，具有优质高产的特点，但对枯萎病的抗性情况一直未有研究。本研究首次就该品种枯萎病感病情况及致病菌开展研究，通过病原菌的分离、纯化及鉴定，明确了引起香蕉天成1号枯萎病的病菌为尖孢镰刀菌，且其与古巴专化型4号生理小种亲缘性最近。明确该病害及其致病菌，可为今后香蕉枯萎病研究和综合防治提供依据。尖孢镰刀菌的遗传变异存在复杂性和多样性，不同生理小种的致病性差异明显，同一生理小种的不同菌株之间也存在致病性差异30。目前尖孢镰刀菌有 4 个生理小种，其中 Foc4 号生理小种是我国香蕉枯萎病的主要致病菌，在热带和亚热带地区均可以致病，且致病力最强，几乎可以侵染所有香蕉栽培品种21，曾经使得我国台湾地区的香蕉种植面积在 20 世纪 70 年代减少了 90%31。本文结合 rDNA-ITS 分子检测手段对分离的病原物进行鉴定，发现引起太空香蕉天成1号枯萎病病原菌与Foc4号生理小种进化距离最近。目前太空香蕉天成1 号处于试种栽培阶段，其抗病性及果实品质有待进一步验证。参考文献 1 Heslop-Harrison J S,Schwarzacher T.Domestication,genomics and the future for banana J.Annals of Botany,2007,100(5):10731084.2 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