感受态细胞制备.doc

感受态细胞制备
一、 实验目的
1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；
2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；
3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。
二、 实验原理
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子每1μg DNA，甚至1 x 109转化子每1μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
物理制备法：
电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109 ~ 1010转化子/μg闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化率（转化子数／每μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)
理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010
三、实验材料
实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、
实验试剂：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。
三、 实验步骤
（一）化学感受态细胞的制备
（1）菌种的活化：取-70℃的冰箱中感受态细胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB的平板上进行划线分离。
（2）菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
（3）菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。
（4）感受态细胞的制备：
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
②弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min。
③弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。
④从冰水中取出4℃、3000转每分钟，离心10min，弃去上清液并用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。
⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml离心管，用剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装40μL悬浮液。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。
（二）电转化的感受态细胞的制备
第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三步相同。
（4）制备感受态细：
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
②弃去上清液，加入30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀充分混匀，在4℃、3000转每分钟下离心10min，倒去上清。重复两次；
③再加入30 mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000转每分钟下离心10min，重复一次。
④弃去上清液，加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast Extraction、0.25% Trypton)，放置在冰上。
（5）准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管40μl，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中， -70℃保存。
（三）效价检测
1、化学转化：
（1）取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。
（2）在含有40μl感受态细胞的0.5ml离心管中加入1µL稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。
（3）将离心管置于42℃干式恒温器上90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却2～3min。
（4）向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400µL，再转移到10ml离心管中，37℃恒温振荡培养45～60min。

（5）将离心管内容物混匀，分别吸取4.4µL和110µL菌液于含有AMP的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在37℃过夜培养，然后通过菌落数计算效价。
2、电转化:
（1）取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。
（2）在含有40μl感受态细胞的0.5ml离心管中加入1µL稀释十倍的标准质粒，充分混匀。然后转移到电击杯中，把电击杯放在电击仪上进行电击（2500V，5ms）。
（3）在电击杯中加入160µL无菌LB培养液（无抗生素），然后充分混匀，吸取于10ml离心管中，置于37℃恒温振荡器中培养45～60min.
（4）分别取2µL和50µL涂板，涂板操作同化学转化。
（5）平板放到37℃的恒温培养箱过夜培养。第二天早上读取两个平板的菌落数。
四、实验结果
1、电转化感受态细胞的效价：涂2µL菌液的平板上菌落数为88个，通过计算知道，电转化感受态细胞的效价为8.8×108。
2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出来结果。
五、讨论
1、感受态细胞制备及转化中的影响因素
①细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。
②质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的标准质粒即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
③试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
④防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
2、效价检测结果分析：
化学转化感受态细胞效价检测结果没有转化成功，而且所有人的结果都没有转化结果，所以造成该结果的可能原因是制备感受态细胞所使用的试剂配制有误。
电化学转化的结果有菌长出，在涂2μl的菌液的平板上有80个菌落。标准质粒的浓度为0.1ng/μl。使用时稀释十倍。所以2μl的菌液中有0.1pg的标准质粒。那么转化率=80/0.1*10-6=8*108