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生物荧光样品制备与观察
一、原理
（一）什么是荧光，简单地讲，当用一定波长的光（如紫外光）照射某种物质时，经过照射的物质在极短时间内即可发射出一种可见的光，这种光即为荧光。
在生物中，由于产生荧光的方式不同，可以概括地归纳为以下几种：
1．自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。
2．次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，这种称为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的核酸。
3．免疫荧光：这种染色法是利用抗原与抗体反应的原理，将荧光染料与抗体结合，然后，将这种标记荧光染料的抗体再与相应抗原结合，即形成抗原、抗体复合物。经一定波长的光激发后，即可发射出荧光，以此辨认抗原在组织细胞内的分布状况。这种方法被称为免疫荧光（或荧光抗体法）。
组织和细胞中所产生的荧光，须借助荧光显微镜方可进行观察，本实验是用普通显微镜配以一种轻便的荧光光源观察荧光现象。
（二）轻便落射光装置
落射光装置的组成：此装置是为普通显微镜配套设计的。它是由两部分组成，一为光源；另一为落射光系统，如图，落射光系统由激发滤片组成。当光线通过激发滤片到达二向分光镜时，使激发光反射，经物镜后，激发标本，标本辐射荧光，又通过物镜，分光镜而到达目镜，以供观察者观察及记录。

二、目的与要求
初步了解生物荧光及荧光染色法，学习几种生物荧光标本的制作与观察。

三、实验内容
（一）生物自发荧光的观察
（二）生物的荧光染色法
（三）荧光抗体法
四、实验步骤
（一）生物自发荧光的观察
1.制片
 （1）取一干净载玻片
 （2）用吸管吸取眼虫培养物，滴于载玻片的中央位置。
 （3）用镊子取一张盖玻片，沿液体的边缘轻轻的盖上盖玻片。
 （4）用吸水纸将盖玻片周边的多余水吸掉。
2.观察
（1）将载玻片置于显微镜载物台上。
（2）调节好光源。可观察。注意眼虫的叶绿体呈现何种颜色？
(眼虫是单细胞生物，生活在淡水中，身体一般呈梭形，具1根鞭毛，能在水中游动，有一红色眼点，能感光。眼虫体内有叶绿体，内含叶绿素，能进行光合作用，在无光环境中，亦可通过体表吸收溶于水中的有机物。)

（二）   吖啶橙染色法
吖啶橙是一种经常使用的荧光染料，它对细胞中的DNA和RNA可同时染色，但显示的颜色却是有差异的。DNA呈绿色荧光，RNA呈桔红色。
1．制片
（1）取一干净载玻片，滴一小滴蛋白胶于载玻片上，涂均匀。稍干。
（2）吸取四膜虫培养液，滴于载玻片中央，待培养液似干未干时，滴加Carnoy’s液固定虫体5－10分钟。
（3）将载玻片放入70％酒精中，停留1－2分钟，然后转入蒸馏水中。
（4）取出载玻片，吸出载玻片上多余水份，转入1％冰醋酸中，停留30秒－1分钟，再转入蒸馏水。
（5）将载片放入0.1％吖啶橙液（pH4.8～6.0）中，染色1－3分钟。
（6）将载玻片放入PBS（pH6.0）液中。
（7）将载玻片放入0.1M CaCl中，分化30秒－2分钟。
（8）转入PBS液中。换3次，每次2－3分钟。
（9）在标本处，滴加PBS－甘油液，轻轻加上盖玻片。
2．观察
（1）用吸水纸，吸去载玻片上多余的水份。
（2）将标本置于显微镜载物台上，调好光源。即可观察。在显微镜下，细胞中DNA部位呈黄绿色（细胞核），RNA呈桔红色（细胞质及核仁）

（三）   荧光抗体法
荧光抗体染色法，根据染色步骤的不同，分为两种。一种为直接染色法，就是将荧光素直接与第一抗体结合，然后，进行抗原抗体反应。另一种为间接染色法，就是将荧光素与第二抗体结合。此法需进行两次抗原、抗体反应。
本实验选用的是间接染色法，反应所用一抗为免抗四膜虫抗体。二抗为羊抗兔FITC抗体，具体操作步骤如下：
1．制片
（1）固定细胞
①取一干净载玻片，画定样品区域（直径0.5cm圆圈），加四膜虫，风干。
②待涂片似干未干时，滴加丙酮：乙醇（1：1）液，固定细胞5～10分钟。
③将载玻片放入PBS液中，经过3次，每次3－5分钟。
（2）第一步抗原－抗体反应
①将载玻片上多余的水擦干，取10ml一抗滴于标本上，放于湿皿内，置于37°C，温育40分钟。
②取出玻片，经PBS液洗3－5次。每次各5分钟。
（3）第二步抗原、抗体反应
①取10～20ml二抗滴于标本上，放于湿皿内，置于37°C，温育40分钟。
②取出载玻片，经PBS液洗3～5次，每次各5分钟。
（4）封片
将载玻片上多余的水份擦干，在标本处滴一小滴PBS：甘油液，轻轻加上盖玻片。
2．  观察
（1）吸去边缘多余液体，将载玻片放在显微镜载物台上。
（2）调好光源即可观察。FITC荧光色素呈黄绿色荧光，观察你的标本中，在细胞的哪些部位有阳性反应。

五、实验用品
（一）实验材料：眼虫、四膜虫、兔
（二）试剂：0.1％吖啶橙染色液，PBS（pH6.0）液，1％醋酸，0.1MCaCl2、蛋白胶、蒸馏水、甘油、PBS（1：9）液，抗体（一抗及二抗），70％酒精，卡氏固定液，乙醇丙酮（1：1）固定液。
（三）器皿：显微镜、轻便荧光光源、载玻片、盖玻片、镊子、染色缸6个、培养皿（9.5cm）5个、培养皿（12.5cm）/个。

荧光显微镜 　在短波长光波(紫外光或紫蓝色光,波长250～400nm)照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400～800nm），这种光称荧光  。某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆氏分色镜。分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只允许特定波长的荧光通过)以保护眼眼及降低视野暗度(图4)。荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的100倍。30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。 40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。 在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。