实验6血红蛋白含量测定.doc

实验6 血红蛋白含量的测定（必修）
酸化血红蛋白稀释测定法（改良沙利氏法）
[目的与原理]
掌握测定鱼类血红蛋白含量的原理和方法，应用改良沙利氏法测定不同鱼类血红蛋白含量。
本实验是应用比色法测定鱼的血红蛋白量。血红蛋白本身的色泽，常随所结合的氧量多少而改变，不便比色。但是加入稀盐酸于血液中可使血红蛋白变成不易变色的高铁血红蛋白，这就可以与标准色相比，从而测出其含量。通常以每100ml血液中含血红蛋白克数来表示，正常鱼血红蛋白含量为7—8g。
[实验对象]
鲤、鲫或草鱼。
[试剂与器材]
血红蛋白比色计，搪瓷盘，注射器，凹瓷盘，小试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，0.1mol/L盐酸（配置盐酸用具），蒸馏水，滴管，纱布，烧杯，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。
[实验步骤]
1、了解血红蛋白比色计的构成 血红蛋白计主要包括吸血管、比色计和比色管等部件。吸血管为一厚壁毛细玻璃管，其上有10μl、20μl的刻度，尾端连有橡皮头，供吸血用。比色计的两侧，装有标准浓度的高铁血红蛋白溶液，也有用比色玻璃柱（或片）来代替的。比色管可插在比色计中，与两侧的标准比色柱进行比色。比色管的两侧通常刻有两行刻度。一行为血红蛋白的绝对值，以g计数（每100毫升血液中所含血红蛋白的克数）来表示，刻度范围为2～22。另一行为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，刻度范围为10%～160%。目前测定常用绝对值来表示。
2、用蒸馏水将比色管洗净，吸血管则依次用蒸馏水，95%酒精和乙醚洗净干燥备用。
3、用滴管加0.1mol/L盐酸4—6滴到刻度比色管内，约加到管下端刻度“2”或“10%”处为止。
4、采血：采血方法见实验49，用吸血管吸血至20μl刻度（要准确）。用绵球仔细将管尖端外面的血拭去。
5、将吸血管中血液轻轻地滴到比色管中盐酸底部，并用上层较清的盐酸溶液反复清洗吸血管3次。使吸血管内的血液完全洗净。切勿带入空气，以至形成气泡影响比色吸血管尖端残留的液体，应在比色管内壁上沥净。取出吸血管后，轻轻摇动比色管使血液与盐酸充分混合，静置15分钟使管内的盐酸和血红蛋白作用完全，形成棕色的高铁血红蛋白。
6、把比色管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。
7、用吸管将蒸馏水逐滴地加入比色管内，每加一滴都应充分混匀并观察比色管内的颜色，直到比色管内溶液的色度和血红蛋白计上标准色度相同时为准，读出管内液面所在的刻度数，（读数应以溶液凹面最低点相一致的刻度为佳）。即为每100ml血液中所含血红蛋白的克数（用g/100ml表示）。
8、实验完毕应将吸血管和比色管洗净，放回盒内。
[方法评估]
采用目视比色法测定血红蛋白含量是比较常用及简便的方法，但此法误差较大，而且同仪器的准确度有关。
[应用意义]
血红蛋白含量与年龄、性别、性周期、营养状况、活动情况、季节变化等有关，营养不良或长期饥饿可引起血红蛋白量显著降低。
[注意事项]
1、用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键。
2、血红蛋白吸管很容易被损坏，应妥善爱护。管内有凝血块时不可用金属丝疏通，可浸泡入氨水或45%尿素溶液中，待血块去除后再用水洗净，并按蒸馏水→ 95%酒精→ 乙醚的顺序清洗，最后吹干吸管。
3、盐酸浓度不可过稀。血液与盐酸作用时间不可过短，必须在10分钟以上方可稀释比色，否则血红蛋白不能充分转变成高铁血红蛋白。最好在30分钟内比色完毕。
4、滴加蒸馏水时，宜少量多次，逐滴加入后混匀比色，以免稀释过度，得不到准确结果。
5、比色应在自然光线下进行，避免在阴暗处或有色灯光下比色，并将比色管刻度转向两侧，以免影响比色效果。

[思考题]
1、实验所得结果，与血红蛋白正常值相对照，有何变异？为什么？
2、血红蛋白含量相对稳定有何生理意义？
3、试讨论血红蛋白含量与水生动物生理机能的关系。

血红蛋白计是用于测定人体血液中所含血红蛋白的百分数或每百毫升中的含量克数。
一般以100%=14.5g。 使用前进行清洗消毒和烘干燥方可使用。
1. 在血红蛋白计比色（稀释）方管内加入1/10当量盐酸到20%处。
2. 末梢采血，用血红蛋白计吸管吸血至20微升刻度线用脱脂棉球揩去管尖端处外部所粘附的血液。
3. 将吸取血液的血管迅速侵入血红蛋白比色方管的盐酸内，慢慢吹血于液体底层，并利用上层的盐酸溶液将吸管内附着的血液洗涤几次，然后摇匀，使血液与盐酸溶液混合而呈现均匀黄褐色，将比色（稀释）方管插入比色架，把无刻度的两侧面放于空隙的前后方，以免妨碍比色。
4. 10分钟后滴加蒸馏水进行稀释，同时进行不断地搅动混合，边滴边观察色泽是否与标准的黄褐色泽相同，至比色(稀释)方管的色泽与标准黄褐色相接近时，应注意逐滴慢慢加入，以免稀释过度，到颜色完全相同时，即停止滴加蒸馏水。此时观察比色管内凹页面最低处的刻度读数数字，即为每100毫升血液中含血红蛋白的克数。

1/10当量盐酸的配置： 购买的浓盐酸为12mol/L，0.1mol/L盐酸的配置：取8.3ml浓盐酸，加入1L的蒸馏水，即为0.1mol/L盐酸。

染色液的配制：
1、姬姆萨（Giemsa）染液的配制
（1）原液配制
Giemsa 粉剂 0.8 g
甘油（医用） 50 ml
甲醇 50 ml
将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于37～40℃温箱内8～12h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。
（2）稀释液
临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）50 ml，即为Giemsa稀释液。
（3）pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液
取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整pH至6.4~6.8，加水至1000ml。
2、 瑞氏（Wright′s）染液的配制
（1）原液配制
瑞氏染料粉剂 0.1g
纯甲醇 60 ml
(2) 配制步骤：
① 将瑞氏染料粉放人乳钵内，加少量甲醇研磨。
② 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研磨，如此反复操作，直至全部染料溶解为止。
③ 装入玻璃瓶内密封，在室温下保存一周即可使用。
④ 新鲜配制的染料偏碱性，放置后呈酸性，染液储存时间越久，染色愈好。

瑞氏（Wright′s）染液的配制需要准备的器材：
100ml 或者200ml 小烧杯或者储备瓶（带有玻璃塞子的），甲醇，瑞氏染料粉剂，乳钵加研磨棒。