荧光假单胞菌与植物病害生物防治.doc

杨合同，王少杰，许勃。1993。荧光假单胞菌与植物病害生物防治。山东科学。6（3）：50－56

荧光假单胞菌与植物病害生物防治

杨合同 王少杰

(山东省生物研究所，济南250014)
许 勃（山东省科委）

摘 要
荧光假单胞菌对多种植物病害具有防治作用，它首先在植物根际定殖，然后靠噬铁索对铁离子的竞争和抗生素的拮抗作用抑制病原菌的生长发育，保护植物体免受病菌危害，荧光菌在根际的定殖能力与它同根系分泌物的凝集能力有关，与它在根表的短期不可逆吸附也有一定关系.荧光菌菌剂研究较多，目前最好的可贮存一年.虽然荧光菌已成功地用于一些病害的生物防治，但仍有许多问题有待解决。
关键词:荧光假单胞菌;噬铁素;抗生素;病害生物防治
大多数好气性和兼性厌气微生物能产生一种低分子量化合物，用以在低铁生境中获取铁索营养，这种物质对铁离子Fe3+具有专一的高度亲和性，称为噬铁素(Siderophore)．荧光假单胞菌的水溶性荧光色素就是一种噬铁素，这类细菌对植物生长发育导有良好刺激作用，并能防治某些植物根部病害，是植物病害生物防治中研究较多的一类噬铁素产生菌，下面以荧光假单胞菌为主介绍有关研究概况。
荧光假单胞杆菌的主要种类群
荧光假单胞菌有8个种，其中菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)，丁香假单胞菌(P. syringae)和绿黄假单胞菌(P. viridiflava)是植物致病菌，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是机遇性人体致病菌，偶尔也造成洋葱腐烂;另外4个种是腐生性的，分别为荧光假单胞菌(P. fluorescens)，绿针假单胞菌(P. chlororaphis)，致金假单胞菌(P. aureofaciens)和恶臭假单胞菌(P. putida)．这些种类均能产生扩散性荧光色素，但与植物病害防治有关的主要是荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。
1.1荧光假单胞菌的主要特征
细胞有多根极生鞭毛，可水解明胶，不产生绿脓菌素，氧化酶反应阳性，精氨酸双水解酶阳性，产生黄绿色荧光色素，不需要生长因子，能利用葡萄糖和芳香族化合物生长，不利用淀粉，细胞可为EDTA溶解，最高生长温度为35-37C。
1.2 恶臭假单胞菌的主要特征
细胞大，长度可超过4um，不水解明胶，不产生绿脓菌素，氧化酶和精氨酸双水解酶均呈阳性反应，最高生长温度为35~37C.
生物防治作用
荧光假单胞菌Cl2(P．fluorescens)和假单胞菌A2(Pseudomonas spp.)两个菌株对蘑菇褐斑病具有防治作用，能使无病斑蘑菇产量提高8.0-16.6%，业已形成商业化生产．Olivier等用非致病性托拉氏假单胞菌(P. tolaasii)和荧光假单胞菌喷布菇床覆盖物，蘑菇褐斑病发生率降低了40-60%．小麦根及际有大量荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌存活，它们的群体大小与小麦全蚀病(Gaeumonnmyces graminis var. tritici)的自然衰退有关.有些菌株在平皿上对小麦全蚀病菌有抑制作用，用于处理小麦种子可有效控制全蚀病的发生，防治效果可达80%以上．从镰刀菌(Fusarium spp.)抑病土壤中分离的恶臭假单胞菌等能转变诱病土壤为抑病土壤，能抑制镰刀菌厚垣孢子的萌发.Kloepper等的研究结果表明，P. fluorescens组群的菌株喷布马铃薯种薯后细菌可迅速定殖于根系并沿新根发展，最终取代根围土居微生物，结果植物生长加快;植物生长的增强不仅发生于天然土壤中，没有抑菌作用的突变株不表现这种效应，说明荧光菌对植物根际有害微生物具有防治作用，减轻了有害微生物对植物体的不良影响，从而表现为植物生长发育的改善.Loper等发现，某些对植物有害的假单胞菌(包括荧光菌)能产生吲哚乙酸(IAA)，可导致甘蔗根系畸形生长，阻止新根伸长;Suslow发现，有些土壤噬菌体能削弱根际有益细菌对植物生长的促进作用，这说明并非所有荧光假单胞菌均可用于防治植物病害和改善植物生长状况，有些菌株本身就有害，有益菌也受其它因子的限制，要求在筛选生防菌时应充分考虑细菌本身的性状及其影响因素．Schroth和Hancock指出，长期的病害生物控制与一大群微生物有关，而短时的生物防治则仅与一种"关键"的微生物有关．荧光假单胞菌可降低马铃薯根际真菌群体23-64%，革兰氏阳性细菌群体25-93%;对小麦全蚀病有防治作用的荧光假单胞菌施于种子上后能于小麦根标定殖存活，说明利用某一种"关键性"微生物短时内防治植物病害是有内在基础的．近年来，利用荧光假单胞菌防治植物病害的例子越来越多，如防治棉花立枯病(Rhizoctonia solani)，棉花粹倒病(Pythium ultimum)，小麦根腐病(Pyhthium spp.)，烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var. nicotianae)，以及水稻鞘腐病(Sarocladium oryzae)等，表明利用一种微生物防治植物病害是完全可行的。

生物防治机理
3.1营养竞争
荧光假单胞菌能使蘑菇褐斑病发生率从l00%降低到7.6-11.l%,Nair和Fahy认为与营养竞争有关;在平皿上，荧光菌对病原细菌(P.tolaasii)没有抑制作用，只存在对营养物质的竞争;后来的研究结果认为主要是通过对铁离子(Fe)的竞争影响病原菌的生长，荧光假单胞菌产生的噬铁素络合根围铁离子，使病菌得不到足够的铁索营养，生长发育受到抑制，对植物体的危害减轻，因而植物生长发育得到改善，用强离子络合剂EDDHA所做的模拟试验也证明了这一点;在小麦全蚀病、亚麻枯萎病的生物防治中，都是通过这一机制起作用. Misaghi等发现，在平皿上荧光假单胞菌能抑制多种病原真菌的生长，包括Rhizoctonia solani, Sclerotinia, Sclerotiorum, Phymatotrichun omnivorum，Phytophthora megasperma，和Pythium aphanidermatum的生长，但培养基中加入铁离子(Fe)可减弱或抵消这种抑制作用，有力地说明病害防治与噬铁素络合铁离子有关．除铁离子外，是否还与其它营养物质的竞争有关，尚无充分的根据．
3.2位点竞争
作为生防菌，荧光假单胞菌首先能够定殖于作物根际或根表，然后依靠所产生的噬铁素或抗生素起作用，这一点已为许多研究工作所证实。例如，以浓度为1O8cfu/ml的荧光菌菌株D93和D98菌悬浮液浸种，小麦出苗后5-10天内接种菌在根部的数量急剧上升，此后趋于稳定或略有下降，在68天时仍保持较高菌量，另外还发现，叶面喷雾后细菌可在小麦叶表和叶内定殖，并能由上向下转移到根部．作者以荧光菌菌株P32等处理小麦种子，发现细菌能在幼根表面形成一均匀保护层，其厚度约为10个菌体长度左右;没有防病作用的菌株则不产生保护层，仅有随机出现的微菌落(约10-20个菌体)这说明，细菌在根部的定殖保护了病原菌的侵染位点，减少了浸染机会，是防病作用的关键因素之一．据报道，荧光菌在根际定殖的能力与它同根系分泌物的凝集反应有关，这为生防菌的筛选工作提供了又一个重要依据。
3.3抑菌作用
噬铁素虽通过对铁离子的竞争抑制病原菌生长，但还不是真正的抑菌作用，也不是抑菌物质的全部．荧光菌可产生多种抗生素，对病原菌有较强的杀伤作用．已发现的抗菌物质不只一种，如荧光假单胞菌产生的氯化苯基吡咯类抗生素有两种，一种是Pyroluteorin,可防治棉苗腐霉菌猝倒病，但对丝核菌立枯病无效;另一种是Pyrrolnitrin,仅对丝核菌立枯病有效，而对腐霉菌猝倒病无效;Pyroluteorin在细胞生长过程中释放到胞外，而Pyrrolnitrin于细胞解体后释出;Pyrrolnitrin对Thielaviopsis basicola, Verticillium dahliae和Alternaria spp.也有抑制作用，它在湿土中可维持活性1个月以上．最近,在小麦全蚀病生防菌(P. fluorescens)中发现了另一种抗生素吩嗪-1-羧酸，它在小麦根际的数量与细菌防治全蚀病的效果有正相关系．一般地，证明抗生素在生防中的作用仅使用无抗生素产生能力的突变株作为对照，而吩嗪-1-羧酸在土壤和根际的直接发现为抗生素的重要作用提供了直接证据．
3.4溶菌作用
有关报道较少，证据尚欠充分，但其可能性不容否定．电镜观察表明，荧光菌D93处理后，小麦根表及根内全蚀病菌菌丝体明显减少，有的菌丝表面还附着细菌体，有的菌丝经细菌破坏后可见许多大小不等的穿孔，部分菌丝己经断裂或解体，这可能是溶菌作用的表现．
菌剂生产
Nair和Fahy曾设计一种泥炭土制剂用于荧光假单胞菌的商品化生产，将含水量50-60%(W/W)的泥炭土调至中性,Y-射线灭菌后装入聚乙烯塑料袋，再混入P. fluorescensC12和Pseudomonas spp. A2的培养物，于25C培养4-5周即成，这种制剂的商品价值可保持近4个月;使用时，将菌剂与菇床用菜园土混合即可.Kloepper和Schroth设计了一种干粉制剂用于马铃薯种薯处理，首先把黄原胶高压蒸汽灭菌，加到细菌悬浮液(10亿细胞/毫升)中混匀，放置20分钟后再加入干燥的无菌滑石粉，混合物于l2C下摊成薄层自然干燥3-4天即为成品;当黄原胶用量达20%时，40C下可维持细菌群体2个月不变，接种马铃薯块茎很方便．Weller和Cook把细菌悬浮于1.5%的甲基纤维素中(1-10亿细胞/毫升)，直接处理小麦种子，风干后于5C下贮存5周，种子上的荧光菌仍有一千万CFU/粒左右．
目前普遍认为Kloepper和Schroth设计的干粉制剂是荧光假单胞菌最好的剂型，在此基础上，Caesar和Burr通过改善细菌培养条件，如向培养基中添加适量蔗糖、甜菜碱等，把菌剂有效贮存期提高到一年，对于商业化生产很有利．
存在的问题
利用荧光假单胞菌已成功地防治了多种植物病害，但仍有许多问题有待解决，比较突出的有:
1、菌株的有效性．荧光假单胞菌生防菌株的防治效果一般为50-60%，还有很大潜力可控，扩大筛选范围和在田间直接筛选可能是找到优良菌株的可靠途径。
2、作用机制研究．已明确荧光假单胞菌首先在作物根际定殖，然后靠竞争及抗生作用抑制病害发展;其它作用机制尚无定论．但噬铁素及抗生素的种类与防病效果有很大关系，如在小麦全蚀病生防中，荧光菌B10的防治作用受FeCl3抑制，而在烟草黑胫病中，荧光菌CHAO的防治效果需要有足够FeCl3才能表达，这反映了荧光菌防病机制的复杂性.研究不同噬铁素及抗生素的作用机制，对于筛选有效菌株，指导病害生物防治具有重要意义．
3、菌株筛选的依据．大多数荧光菌的筛选仅依靠平皿上对目标病原菌的拮抗作用，而实际上与生防有关的性状很多，如在根际的定殖能力，对不同环境的适应能力等;这需要简便快速的筛选技术及可靠的筛选标准，但目前这两方面的研究工作尚有许多不足之处．
4、菌剂制备．目前，荧光假单胞菌菌剂的生产成本较高，贮存期较短，在应用上处于不利局面．虽然改善培养条件后有效贮存期大大延长，成本显然不够经济。
5、防效不稳定．这是大部分生物防治研究在应用方面普遍遇到的问题，荧光菌也不例外．应对菌株进行人工改良，或采用混合群体，使之具有更好的抗菌能力和较强的适应能力，发挥最大的防病潜力，在这一方面，彭于发等作了有益尝试，他们使用转座子诱变法对荧光菌菌株CNl2进行遗传改造，得到突变株荧光93，荧光93对小麦全蚀病的防效高于自然菌株CNl12说明人工改良是获得优良生防菌的一种可行手段。
6、菌株的有害性．菌株对作物的不利影响是生防菌筛选过程中应注意的问题，植物体对噬铁素的种类具有选择性，不相适应的组合中，植物体产生缺铁症状，例如，假单胞菌素(Pseudobactin)可抑制玉米等几种作物对铁的吸收，玉米表现缺铁症.