总RNA的提取定量与RT-PCR.doc

完整)总RNA的提取定量与RT-PCR

生物化学实验报告

姓 名：

学 号:

专业年级: 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称
（Title of Experimetn）
总RNA的提取、定量与RT—PCR
实验日期
(Date of Experiment）
11月27日
实验地点(Lab No。)
第二实验室
合作者（Partner）

指导老师(Instructor）

总分
（Total Score）

教师签名(Signature）

批改日期
（Date）

【预习报告】
一、 实验原理
1)总RNA的提取与定量
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80％—85％，tRNA和核内小分子RNA占10—15%,而mRNA只占1—5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20—250个多聚腺苷酸（polyA)。利用此特点，用oligo（dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍—有机溶剂法,氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法.
Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA.TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
Trizol试剂可用于小量样品（50～100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、〉107细胞）。对人,动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern blot,dot blot,ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting.
2）逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能.
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、 实验材料
1)总RNA 的提取
1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管
2。 Trizol试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5。 75℅乙醇
6. 无RNase的水或0。5℅SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制)
2）RT-PCR
1. 基因扩增仪（如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700）、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄PCR反应管
2．RNA提取试剂
3．第一链cDNA合成试剂盒
4．dNTP mix：含dATPdCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L
5．Taq DNA聚合酶

三、 实验步骤
（一）总RNA的提取
1。 匀浆处理：
a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50—100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积不应超过Trizol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞，每5—10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Trizol,反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解.一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理.
(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提;细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)
2. 将匀浆样品在室温（15—30℃）放置5 min,使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪,多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等)可于2-8 ℃ 10000×g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作.
4。 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。
（注意:此步振荡非常重要,建议在旋涡振荡器上进行。）
5. 2-8℃10000×g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。
6. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相)，用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0。5ml异丙醇,室温放置10 min。
7. 2-8℃10000g离心10 min,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀.移去上清。
8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀.每使用1ml Trizol至少加1ml 75℅乙醇.2-8℃不超过7500g离心5 min，弃上清。
9。 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min.加入25—200μl无RNase的水，-70℃保存。

（二）RT—PCR
1. 总RNA的提取：见前述内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为例.
（1）在0.2ml微量离心管中,加入以下：
总RNA 1-5 μg 、dNTP 1 μl 、Random primer 1 μl 、补充适量的DEPC H2O使总体积达10 μl.轻轻混匀、离心。
（2）PCR仪上65℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
（3）然后加入下列试剂的混合物：
5×PrimeScript buffer 4 μl 、RNase inhibator 0.5 μl 、RTase 1 μl 、RNase free H2O 4。5 μl ，
轻轻混匀，离心.
（4） 30℃孵育10 min。
（5） 42℃孵育60 min。
(6）于70℃加热15 min以终止反应，将管插入冰中。
3．PCR：［本次实验采用Premix Taq Version2。0(Loading dye mix）试剂]
（1）取0。5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl 、上游引物(10pmol/L）2 μl 、下游引物（10pmol/L）2 μl 、dNTP（2mmol/L） 4 μl 、10×PCR buffer 5 μl 、Taq酶（2U/μl） 1 μl .
(2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl.轻轻混匀，离心。
（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G—3—PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照.
（4）电泳鉴定:进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5）结果分析:采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。

四、实验注意事项
1、本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。 
2、快速的操作,低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。
3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加.

【实验记录】
一、 实验条件
见第一、第二部分.
二、 实验现象

1、 琼脂糖凝胶电泳图像：
反转录DNA条带
MARKER带

从凝胶电泳的图像上看，本组的反转录DNA条带可以看到与MARKER带对应的特异性条带，但特异性不明显，也出现了弥散或非特异性条带。
【结果与讨论】
一、结果
如上图所示。
三、 讨论
（1）特异性反转录DNA条带不明显， 且有弥散或非特异性条带，说明在总RNA的提取上存在缺陷，导致RNA提取量不足且反转录产生其他DNA片段。
具体原因可能包括
1） 多种原因导致RNA降解或断裂,如操作时间过长,存在污染物，实验中保存温度过高，溶液或离心管未经RNase去除处理，细胞在用酶处理时过度等
2） 细胞裂解不充分，RNA提取量不足
3） 吸取RNA上清液时存在少量DNA杂质
4） RNA提取时未完全溶解，导致RNA量不足