提取方法对茭白多糖结构及生物学活性的影响.pdf

2023年第36 卷第8 期功能与营养摘要：以艾白多糖为研究对象，采用热水提法、超声波酶法、微波法及低共熔溶剂法制备荧白多糖JB-1、JB-2、JB-3和JB-4,研究其结构及生物学活性。结果表明:JB-1 JB-4均含有糠醛酸和蛋白质,不含硫酸根,其中JB-4多糖得率、糠醛酸含量最高,蛋白质含量最低;JB-1 JB4均由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和木糖组成;JB-2JB-4具有三螺旋结构,JB-1没有此结构。4种多糖均有一定的抗氧化能力,但均不如维生素C。在降血脂上,JB4 比其他多糖具有更好的降血脂能力。综上所述，茭白多糖最优提取方法为低共熔溶剂法。关键词：艾白；多糖；提取方法；抗氧化能力；降血脂能力Effect of extraction methods on the structure andbiological activity of Zizania latifolia Turcz.polysaccharidesJIA Shan-shan,PENG Yuan,WANG Lu,REN Chen-chen,LIU Li-ying2,LI Chang-zheng(1.Sanquan College,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,Henan,China;2.Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha 410008,Hunan,China)Abstract:Taking Zizania latifolia Turcz.polysaccharides as the research object,Zizania latifoliaTurcz.polysaccharides JB-1,JB-2,JB-3 and JB-4 were prepared by high temperature water extraction,ultrasonic enzymatic method,microwave method and low eutectic solvent method,and their structuresand biological activities were studied.The results showed that JB-1-JB-4 contained furfural acid andprotein,but no sulfate.JB4 had the highest polysaccharides yield and furfural acid content,while thelowest protein content.JB-1-JB-4 were composed of galacturonic acid,glucose,galactose,arabinose,mannose,rhamnose and xylose.JB-2-JB-4 had a triple helix structure,while JB-1 had not.Four poly-saccharides had certain antioxidant abilities,but none were as good as vitamin C.JB4 had better hypo-lipidemic ability than other polysaccharides.In summary,the best extraction method of Zizania latifoliaTurcz.polysaccharides was the low eutectic solvent method.Key words:Zizania latifolia Turcz.;polysaccharide;extraction method;antioxidant ability;hypolipi-demic ability中图分类号：TS201.1菱白含有多种营养物质,如氨基酸、维生素、多酚和黄酮等，具有抗氧化、抗癌、保鲜、调节免疫力收稿日期：2 0 2 3-0 5-2 8基金项目：河南省科技攻关项目（2 2 2 1 0 2 31 0 37 4）；河南省科技攻关项目（1 2 91）；新乡医学院三全学院骨干教师培养计划（SQ 2 0 2 3G G JS0 5）；校级教改课题（2 0 2 1 XJJG23）作者简介：贾闪闪（1 98 9一）女，硕士，讲师，研究方向为药物提取和活性成分及作用机制研究。通信作者：李长正（1 957 一）男，博士，教授，研究方向为肿瘤分子生物学及药物干预机制。粮食与油脂提取方法对菱白多糖结构及生物学活性的影响贾闪闪，彭媛，王璐，任晨晨，刘立英，李长正（1.新乡医学院三全学院，河南新乡4530 0 3；2.中南大学湘雅医学院,湖南长沙41 0 0 0 8)文献标志码：A文章编号：1 0 0 8-9 57 8(2 0 2 3)0 8-0 1 33-0 6等活性1-2 。植物多糖是1 种天然生物活性物质,主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖等组成3,具有133134抗氧化、抗癌等活性，在医药食品中有广泛应用4-5。多糖的生物活性与其分子质量和结构相关,分子质量越小，抗氧化能力越强。但也有研究6-7 表明,多糖的分子质量越小并不是对自由基清除能力就越强，而是与其结构相关。多糖的提取工艺直接影响多糖化学组成和分子质量，也会影响其生物学活性。目前多糖的提取工艺主要有热水提法、超声波法、酶法、微波法及低共熔溶剂法等。本试验以菱白为原料，采用热水提法、超声波酶法、微波法及低共熔溶剂法制备菱白多糖，研究其化学组成和结构差异及其抗氧化和降血脂活性差异,筛选出高活性菱白多糖的提取工艺，以期为菱白多糖的研究和菱白深加工提供参考。1材料与方法1.1 材料与试剂白，市售；半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、木糖标准品，北京索莱宝科技有限公司；胰脂肪酶（50 0 U/g）、纤维素酶（1 0 U/m g）、维生素C、A BT S,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨胆酸钠、牛黄胆酸钠，上海麦克林生物科技有限公司；SPF级雄性昆明小鼠（体质量182 2 g）,购自河南省实验动物中心（许可证号为SCXK（豫)2 0 2 1-0 0 0 9）；氯化胆碱、二甲基亚矾、三氯乙酸、无水乙醇、铁氰化钾、苯酚、浓硫酸，分析纯。1.2仪器与设备LC-WB-6智能恒温水浴锅，上海市力辰科技有限公司；MST-3506全自动多功能酶标仪，山东恒美科技有限公司；YM-008多功能超声波清洗机，深圳市方奥微电子有限公司；MDS-6G微波萃取仪，上海新仪微波化学科技有限公司；FTIR-650S傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技股份有限公司；APS-8026PLUS高效液相色谱仪，德国奥普斯仪器设备有限公司;RE-5003（EX）防爆旋转蒸发仪，郑州凯瑞仪器设备有限公司。1.3试验方法1.3.1艾白多糖的制备热水提法：称取1 0 g菱白粉（菱白清水洗净后，切片，以6 0 烘干，粉碎过0.42 5mm筛）置于400mL100水中煮沸提取4h后，过滤取上清液，旋蒸至原体积的0.1 倍后，用无水乙醇调至乙醇体积分数9 5%，以4静置过夜，然后以50 0 0 r/min离心1 0 min，沉淀以50 烘干，用水复溶至10mg/mL,采用纤维素-琼脂糖凝胶柱纯化（先用去粮食与油脂离子水洗涤后，再用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱收集），透析脱盐后浓缩烘干，即为热水提法菱白多糖(JB-1)3。超声酶法：称取1 0 g菱白粉置于40 0 mL60水中,添加质量分数2%纤维素酶后，以40 0 W超声提取30 min后，过滤取上清液，后续纯化方法同热水提法，制得超声酶法菱白多糖（JB-2）。微波法：称取1 0 g菱白粉置于40 0 mL50水中，以40 0 W微波提取1 0 min后，过滤取上清液，后续纯化方法同热水提法，制得微波法菱白多糖（JB-3)4。低共熔溶剂法：以尿素-氯化胆碱摩尔比1：1 9作为提取溶液，将1 0 g菱白粉置于2 0 0 mL70提取溶液中,浸泡提取42 min后，过滤取上清液，后续纯化方法同热水提法，制得低共熔溶剂法菱白多糖(JB-4)。1.3.2小鼠肝脏匀浆液制备取小鼠肝脏，清洗干净后，添加1 0 倍肝脏质量的生理盐水后匀浆,以50 0 0 r/min离心1 0 min,取上清液即为小鼠肝脏匀浆液。1.3.3艾白多糖结构测定JB-1JB-4中的多糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量和硫酸根含量分别根据苯酚硫酸法3、考马斯亮蓝法 、硫酸咔唑法8 和硫酸钡比浊法 测定；单糖组成采用盐酸高温水解后，根据1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮柱前衍生-高效液相色谱法测定7 ;三螺旋结构、分子质量和官能团分析分别根据刚果红染色法、高效液相凝胶色谱法和傅里叶变换红外光谱仪进行测定1 0 1.3.4茭白多糖抗氧化能力评价以铁离子还原率7 、羟基自由基清除率7 ABTS自由基清除率1 及抗脂质氧化率1 2 为评价指标,对不同质量浓度的 JB-1 JB-4 多糖进行测定,以同质量浓度的维生素C作为对照。1.3.5艾白多糖降血脂能力评价以胰脂肪酶活性的抑制作用1 3、甘氨胆酸钠结合率1 4 和牛黄胆酸钠结合率1 4 为评价指标,对不同质量浓度的 JB-1JB-4多糖进行测定。2结果与分析2.1不同提取方式对艾白多糖结构的影响2.1.1提取方式对茭白多糖化学组成的影响由表1 可知:JB-1多糖得率、糖醛酸含量最低，蛋白质含量最高,而JB-4多糖得率、糖醛酸含量最2023年第36 卷第8 期/%02023年第36 卷第8 期高,蛋白质含量最低。不同提取方法对细胞壁造成的破坏程度不同，也影响其多糖得率,并且辅助提取法具有一定的修饰作用,如降解等,可以使多糖不表1 提取方式对菱白多糖化学组成的影响/%多糖多糖得率JB-16.71 0.09cJB-29.74 0.18aJB-38.90 0.14bJB-410.45 0.28a注：同列不同字母表示差异显著；“-”表示未检出，下同。多糖半乳糖醛酸JB-122.03 0.05dJB-223.00 0.07cJB-323.64 0.09 bJB-424.56 0.06a2.1.3提取方式对白多糖三螺旋结构的影响由图1 可知:JB-1刚果红溶液与空白刚果红溶液相比,最大紫外吸收波长呈现下降趋势，说明没有三螺旋结构;而JB-2JB-4与空白刚果红溶液相比,最大紫外吸收波长未呈现下降趋势，说明具有三螺旋结构。多糖的构象不仅与糖苷键连接、支化程度及取代基团的静电排斥作用有关，还与提取溶液的性质和方式有关,JB-2JB-4具有三螺旋结构，可能是受提取方式和溶剂性质的影响1 6 。510rJB-1-JB-4空白-JB-3505u/斗500495490F4854804750图1 提取方式对白多糖三螺旋结构的影响2.1.4提取方式对艾白多糖红外光谱的影响由图2 可知：不同提取方式得到的菱白多糖在4004000cm-红外下形成的光谱图差异很小,仅在出峰强度上稍有差异，在出峰位置上几乎没有差异,说明提取方式对多糖的一级结构没有造成影响。粮食与油脂稳定的键断开,从而提高多糖得率或活性。2.1.2提取方式对艾白多糖单糖组成的影响由表2 可知:JB-1JB-4均由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和木糖组成，其中半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量较蛋白质含量糖醛酸含量 硫酸根含量1.24 0.09 a16.86 0.35b0.51 0.03b18.74 0.41a0.52 0.03b18.05 0.46a0.42 0.02c19.01 0.48 a表2 提取方式对白多糖单糖组成的影响葡萄糖半乳糖24.00 0.06b21.36 0.08b24.36 0.05a20.43 0.09c22.59 0.08d21.68 0.07a23.14 0.07c20.26 0.06dO0.1NaOH浓度/(mol/L)135高。4种提取方式的菱白多糖单糖各组成均有差一别,表明不同提取方式对茭白多糖单糖组成具有一一定影响。这是因为不同提取方法在溶剂、温度和方一式有差异,导致溶解多糖组分不同,其单糖组成种一类差异很小,但含量会有差异1 5。阿拉伯糖甘露糖20.37 0.05b3.52 0.01a21.03 0.06a3.30 0.02b20.22 0.05b3.29 0.01b20.09 0.05c3.05 0.01c110100%/率米到908070605040003.500300025002 00015001 0005004011010090%/率米墅807060504030204000350030002500200015001000110100%/率墅908070605040300 003 00 00 00 00 0 005 0034220.20.3鼠李糖4.55 0.01b4.21 0.01c4.52 0.01 b4.62 0.02 a139629241 6481 0433428波数/cml(a)JB-114012.9251042Y3.4241639波数/cml(b)JB-22921163010670.40.5木糖4.17 0.01b3.67 0.01 d4.06 0.02c4.28 0.01a56205665000567399波数/cm(c)JB-3110%/率米墅1009080706050400 3 0023 00 500 001 001 00 50003426图2提取方式对茭白多糖红外光谱的影响13902930105416481波数/cml(d)JB-45610136在340 0 cm-左右为0 H的伸缩振动,是多糖的典型峰;在8 97 cm-左右为-吡喃型多糖的特征峰。2.1.5提取方式对艾白多糖分子质量的影响由表3可知：4种提取方式的多糖均由3个组组分1多糖分子质量/kDaJB-113 124 316aJB-213 352 285aJB313 232 302aJB-413 254 299a2.2茭白多糖抗氧化能力比较分析2.2.1提取方式对艾白多糖铁离子还原率的影响由图3可知：JB-2JB-4的最大铁离子还原率与维生素 C差异不明显,但JB-1 明显低于维生素C。维生素C、JB-1 JB4 的ICso分别为1 6.43、45.24、38.1 1、39.0 7、33.2 4m g/L，表明低共熔溶剂法制备白多糖具有较强的铁离子还原率，但仍不如维生素 C。维生素C100JB-14JB-2JB-380 JB-460F40F20F0图3提取方式对茭白多糖铁离子还原率的影响2.2.2提取方式对茭白多糖羟基自由基清除率的影响-维生素C100F二JB-1JB-2JB-380$JB-4%/塑甲月60F40F2000图4提取方式对茭白多糖羟基自由基清除率的影响粮食与油脂分组成,且同组分的分子质量均无明显差别，但其同组分含量却有差异，说明不同提取方式对多糖的分子质量有明显影响，低分子质量多糖更容易穿越细胞屏障系统,具有更好的生物学活性。表3提取方式对白多糖分子质量的影响组分1含量/%分子质量/kDa84.65 1.32a283 6d78.95 0.93 b285 7d82.78 1.02a281 6d74.34 0.84281 7d12040质量浓度/(mg/L)2040质量浓度/(mg/L)2023年第36 卷第8 期组分3含量/%分子质量/kDa4.02 0.11a51 2d3.43 0.08b54 3d3.37 0.08b53 2d2.52 0.0552 2d由图4可知:JB-1JB-4的最大羟基自由基清除率差异不明显,但均低于维生素 C。维生素C、JB-1JB4的ICso分别为1 3.0 2、44.50、36.38、32.47、34.28mg/L,表明微波法制备菱白多糖具有较强的羟基自由基清除率，但仍不如维生素C。2.2.3提取方式对艾白多糖ABTS自由基清除率的影响由图5可知:JB-1JB4的最大ABTS自由基清除率差异不明显,但均低于维生素 C。维生素 C、JB-1JB-4的ICso分别为2 5.0 9、50.2 4、42.9 5、45.66、44.1 3m g/L,表明超声酶法制备菱白多糖具有较强的ABTS自由基清除率,但仍不如维生素C。维生素C100F-JB-3804 JB-460806080含量/%11.33 0.22d17.62 0.35b13.85 0.23c23.14 0.37a10060F40F2000图5提取方式对菱白多糖ABTS自由基清除率的影响2.2.4提取方式对茭白多糖抗脂质氧化率的影响由图6 可知:JB-1JB-4抗脂质氧化率差异不明显,但均低于维生素 C。维生素 C、JB-1 JB-4 的 ICso分别为42.0 6、6 7.97、6 5.0 8、6 7.0 3、59.94mg/L,表100明低共熔溶剂法制备白多糖具有较强的抗脂质氧化率，但仍不如维生素C。2040质量浓度/(mg/L)60801002023年第36 卷第8 期-维生素C80JB-2-0JB-1JB-3-4JB-4%率期60F40F20F0图6 提取方式对茭白多糖抗脂质氧化率的影响2.2.5提取方式白多糖抗氧化能力综合评价将抗氧化能力从大到小分别赋分值为4、3、2、1,并将其每项赋分进行累和,得到每种提取方式白多糖的抗氧化能力和。经过计算得出 JB-1JB-4的抗氧化能力和分值分别为4、1 2、1 0、1 4,即4种提取方式的总抗氧化能力大小为JB-4JB-2JB-3JB-1,表明低共熔溶剂法制备菱白多糖具有最强的抗氧化能力。不同提取方式制备的菱白多糖中分子质量50 kDa的多糖含量趋势与抗氧化能力大小趋势相同,说明分子质量50 kDa的多糖含量可能影响了不同提取方式制备的茭白多糖的抗氧化能力。2.3艾白多糖降血脂能力比较分析2.3.1不同提取方式的艾白多糖对胰脂肪酶的抑制作用由图7 可知：随着多糖质量浓度的增大，4种方式提取菱白多糖的胰脂肪酶抑制率均呈现先上升后平稳的趋势。JB-1JB-4的ECso分别为3.1 2、2.61、2.6 4、2.2 2 m g/m L,说明低共熔溶剂法制备菱白多糖具有较强的胰脂肪酶抑制作用。对胰脂肪酶抑制活性能力影响最大的因素是纯度,纯度越高100 B-2o-B-290F3-JB-480F7060F50F403020100图7 不同提取方式的茭白多糖对胰脂肪酶抑制率的影响粮食与油脂其抑制率越高1 7 。JB-1 纯度较低,因此其抑制胰脂肪酶活性最差,但 JB-2JB-4 胰脂肪酶抑制率不同可能是由单糖组成、分子质量等差异所导致。2.3.2不同提取方式茭白多糖对甘氨胆酸钠的结合作用由图8 可知：不同提取方式的菱白多糖均可以与甘氨胆酸钠结合，且均随着多糖质量浓度的增大呈现先上升后平稳的趋势。JB-1JB-4的ECso分别2040质量浓度/(mg/L)24质量浓度/(mg/L)137608068010010为5.8 5、5.92、5.46、4.6 2 mg/mL，说明低共熔溶剂法制备菱白多糖具有较强的甘氨胆酸钠结合作用。760F 8-45040F30F20F10F%图：不同提取方式菱白多糖对甘氨胆酸钠结合率的影响2.3.3不同提取方式白多糖对牛磺胆酸钠的结合作用由图9可知：不同提取方式的菱白多糖均可以与牛磺胆酸钠结合，且均随着多糖质量浓度的增大呈现先上升后平稳的趋势。JB-1JB-4的ECso分别为5.2 7、5.1 4、5.1 3、4.0 6 mg/mL,说明低共熔溶剂法制备菱白多糖具有较强的牛磺胆酸钠结合作用。不同提取方式制备菱白多糖在化学组成、单糖组成和分子质量上有较大差异,影响了其与胆盐的吸附作用。8070FJB-460F50F40F30F20F10F图9不同提取方式菱白多糖对牛磺胆酸钠结合率的影响224质量浓度/(mg/L)46质量浓度/(mg/L)6881010138综上所述,JB-4降血脂效果最好,说明低共熔溶剂法制备菱白多糖具有较强降血脂作用,可能与其低分子质量多糖含量较高有关。3结论以菱白多糖为研究对象,采用热水提法、超声酶法、微波法及低共熔溶剂法制备菱白多糖JB-1、JB-2、JB-3和JB-4,研究其结构及生物学活性。结果表明:JB-1JB-4均含有糠醛酸和蛋白质,不含硫酸根,其中JB4多糖得率、糠醛酸含量最高,蛋白质含量最低;JB-1JB-4均由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和木糖组成;JB-2JB4具有三螺旋结构,JB-1 没有此结构。4种多糖均有一定的抗氧化能力,但均不如维生素C。在降血脂上,JB-4比其他多糖具有更好的降血脂能力。综上所述，菱白多糖最优提取方法为低共熔溶剂法。本研究为菱白多糖的开发利用奠定基础。参考文献 1 NING Y,DU Y M,LIU X M,et al.Morphological char-acteristics,nutrients,and bioactive compounds of Zizanialatifolia,and health benefits of its seeds J.Molecules,2018,23(7):1561.2 H U A NG J,WU W J,NI U B,e t a l.C h a r a c t e r iz a t io n o fZizania latifolia polysaccharide-corn starch compositefilms and their application in the postharvest preservationof strawberries J.LWT-Food Science and Technology,2023,173:114332.【3】汪名春，赵士伟，朱培蕾，等菱白水溶性多糖提取工艺及单糖组成的研究J食品工业科技，2 0 1 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