细胞工程(宿州学院的,为师弟师妹们解决一下忧虑).doc

名词解释
1．细胞工程：利用细胞生物学和分子生物学方法以生物细胞或组织为研究对象，按照人们的意愿进行工程学操作，从而改变生物性状，或产生新物种货品系。
2．植物细胞全能性：每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。
3．外植体：把由活植物体上切取下来的进行培养的那部分组织或器官叫外植体
4．愈伤组织：通常指植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增殖形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。
5．脱分化：离体条件下，细胞脱离原状态而回复到分生状态，这一会变过程称脱分化或去分化。
6．再分化：脱分化的细胞在特定条件诱导下，再次开始新的分化发育过程，最终形成各种组织、器官或胚状体等，称再分化。
7．胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞或胚状体。
8．人工种子：通过植物组织培养中所产生的体细胞胚或珠芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒。
9．胚胎培养：是植物组织培养的一个主要领域。植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。
10．原生质体培养：将植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，使其再生细胞壁，进而分裂形成愈伤组织或胚状体，最后发育形成完整植株。
11．体细胞杂交：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
12．单细胞培养：指从外植体、愈伤组织、群体细胞或者细胞团中分离得到单细胞，然后在一定条件下对其进行培养的过程。
13．平板培养法：将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。
14．看护培养：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
15．动物细胞与组织培养：是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。
16．接触性抑制：由细胞接触而抑制细胞运动的现象称为接触抑制. 接触抑制是体外培养中某些贴附型细胞生长特性之一.由于细胞之间有接触抑制特性,一般的正常细胞并不互相重叠于其上而生长,而是呈单层细胞生长.但肿瘤细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞堆积.因此,接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞之一.
密度抑制：当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止的现象。
17．有限细胞系：原代细胞经过一次传代后，形成的细胞系。如果不能继续传代或传代有限，称为“有限细胞系”
无限细胞系：原代细胞经过一次传代后，形成的细胞系。如果可以连续传代则称为“连续细胞系”，细胞获得不死性（持久增殖能力）。
18．饲养细胞：即滋养细胞，一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。
19．干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
20．胚胎工程：指以动植物胚胎为研究对象而产生的一系列技术操作，如胚胎移植、胚胎冷冻保存、胚胎分割、体外胚胎生产、动物克隆、性别控制及基因导入等。
21：胚胎移植：指对优秀雌性动物进行超数排卵处理，在其发情配种后一定时间内从其生殖道取出早期胚胎，移植到同期发情的普通雌性动物生殖道的相应部位，让其生产后代的技术。
22：超数排卵：在动物发情周期的适当时期，用促性腺激素进行处理，诱发其卵巢上大量卵泡同时发育并排卵的技术，简称超排。
23．固定化培养：将游离的细胞包埋或吸附在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中或表面，培养液呈流动状态进行无菌培养。

选择题、填空题
1. 植物细胞工程是在植物组织培养基础上发展的，建立在细胞学说、细胞全能性
的基础上。
2. 细胞工程基本实验室组成（制备室）（无菌操作室）（培养室）
3. 细胞学观察设备是（普通显微镜）（倒置显微镜），用于观察细胞的生长的情况和有无污染用（倒置显微镜）
4. 无菌操作的仪器设备有（超净工作台）（高压蒸汽灭菌锅）（过滤除菌装置）（干热灭菌烘箱）
5. 无菌操作技术方法中常用的灭菌方法包括物理的（湿热灭菌法），用于对一般培养基、玻璃器皿、橡胶制品等灭菌；（过滤除菌），热不稳定的动物细胞培养液灭菌方法；玻璃器皿的灭菌用（干热灭菌）；接种室、超净台或接种箱内常用（紫外线灭菌）。化学消毒方法（熏蒸消毒）（药剂喷雾消毒）；培养基灭菌用湿热灭菌法和过滤除菌法
6. 化学消毒法中常用的药品：甲醛、高锰酸钾、酒精、来苏儿、次氯酸钙、次氯酸钠、过氧化氢、升汞
7. 生长素中IBA、IAA、NAA、2,4-D诱导细胞的分裂和根的分化，IBA、IAA和IAA诱导生根，2,4-D诱导愈伤组织；细胞分裂素有6-BA、KT、ZT、2iP，促进细胞分裂和分化不定芽；赤霉素，抑制愈伤组织形成，促进芽的形成，常见的有GA3
8. 激素平衡假说：生长素/细胞分裂素高，诱导根的生成，生长素/细胞分裂素低诱导芽的生成，生长素和细胞分裂素必须协调试用才能再生正常植株。
9. 愈伤组织分为（胚性愈伤组织）（非胚性愈伤组织）
10. 人工种子的结构：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮
11. 植物培养基成分：无机成分、有机营养成分、生长调节物质、培养材料的支持物
12. 最常用的植物培养基是MS培养基，其母液的配制包括：大量元素的母液、微量元素的母液、铁盐的母液、有机母液、激素母液
13. 离体快繁出现问题：污染、褐变、玻璃化
14. 脱毒方法有物理方法、化学方法、生物学方法
15. 茎尖脱毒（生物学方法）的原理：病毒在植物体内分布不均，茎尖处一般无病毒或很少。
16. 茎尖越小，脱毒效果越好，但成活率低，剥离技术要求也越高。
17. 植物脱毒效果的检测方法：视觉观察法、指示植物鉴定、血清鉴定法、电子显微镜鉴定法、分子生物学检测法
18. 花药花粉取材时期：一般是单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)
19. 通过花粉培养的植株都是单倍体植株；通过花药培养的植株包括单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体等的混合群体
20. 被子植物胚乳的发育根据其发育初期是否形成细胞壁可分为核型胚乳、细胞型胚乳、招生目胚乳。胚乳发育成的植株一般是三倍体
21. 胚培养分为成熟胚培养和有胚培养
22. 未授粉胚珠—诱导愈伤组织或胚状体—再生植株，形成单倍体植株
已授粉胚珠---胚正常发育过程，形成种子
未授粉子房：来自性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）发育成单倍体植株；
来自体细胞（珠被、子房壁）发育成二倍体植株；
已授粉子房：来自合子或体细胞（珠被、子房壁）产生二倍体植株；若胚乳也能形成，可得到三倍体植株
23. 原生质体体培养时最好取幼嫩叶片，分离方法有机械法和酶解法，常用的酶有纤维素酶和果胶酶
24. 原生质体纯化方法：沉降法、漂浮法、界面法；活力检测方法：目测法、FDA法、伊凡蓝法；原生质培养方法：液体浅层培养法、固体平板法、固液结合培养法；原生质体再生的三个阶段：细胞壁再生、细胞分裂、植株再生
25. 分离时加入渗透压稳定剂的目的：保证原生质体完整性。原生质膜稳定剂为了提高原生质体膜的稳定性和活力
26. 体细胞杂交能试验缘杂交形成新物种的原因：能够实现中间杂交并能获得可育后代
27. 原生质体融合方法：PEG法、电融合技术、无机盐诱导融合、高pH-高Ca离子、PEG结合高钙-高pH诱导法
28. 单细胞分离的方法：机械法、酶解法
29. 单细胞培养的方法有固体平板培养法、看护培养法、微室培养法。
30. 最常用的单细胞培养方法是固体平板培养法，常以植板率来衡量培养效果。植板率：能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。
植板率=（每个平板形成的细胞团数）/(每个平板接种的细胞总数)
31. 植物细胞大规模培养主要有悬浮培养和固定化培养
32. 成批培养/分批培养：将一定量细胞或细胞团接种到一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
特点：（1）除气体交换外，培养系统不与外部进行物质交换。培养基体积固定；
（2）必须适当搅拌；

（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长；
（4）当营养耗尽时，细胞停止分裂生长，完成培养过程，细胞和产物一次性收获。但要进行下一批培养，则需要继代转移。
半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液
33. 植物细胞悬浮培养的生物反应器有机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器
34. 常用的超低温保存方法可分为两类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。
超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、降温冰冻及保存、解冻处理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。
传统的降温冷冻方法：快速冰冻法 、慢速冰冻法 、两步法 、逐级冰冻法
解冻一般采用快速化冻方法，即将液氮保存后的材料在35°C－40°C温水浴中化冻
35. 体外培养的动物细胞依据它们是否贴附在支持物表面生长而分为两大类型，即：贴附型细胞和悬浮型细胞。
体外贴附型细胞形态大致可以分为：成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞
36. 培养细胞生命周期有三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期
37. 冷冻保存细胞应选择原代培养及传代培养早期的细胞。进行各种实验的每一代中最好阶段是对数期
38. 培养基和各种培养用液有平衡盐溶液PBS、消化液。最常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA
39. 动物细胞培养基可分为天然培养基及合成培养基两大类
40. 大多数哺乳动物细胞的培养适宜温度：37℃最适pH为7.2-7.4之间
41. 实验室中动物细胞的培养方法有：悬滴培养法、培养瓶培养法、旋转管培养法、灌注小室培养法、培养板培养法、克隆培养法（单细胞分离培养法）
42. 细胞克隆（单细胞分离培养），即把一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体的培养技术。最常用的克隆培养法是稀释铺板法。
43. 细胞转化及恶性程度检查一般利用软琼脂培养法检测
44. 细胞生长状况
• ①细胞计数，血球计数板和电子细胞计数仪
• ②生长曲线：（潜伏期，对数生长期，水平静止期）由于细胞基数和生长进度不同，生长曲线不一致。
• ③细胞分裂指数，分裂细胞占全部细胞的比例
• ④细胞贴壁率=贴壁存活细胞/接种细胞*100%
• ⑤细胞周期时间测定：用同位素标记，流式细胞仪测定细胞同期
• ⑥细胞活力检测：MTT
45. 动植物细胞融合的方法：仙台病毒法、PEG诱导融合法、电融合法
46. 干细胞按分化潜能大小来分类：全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞；根据来源来分：来源于胚胎--胚胎干细胞 、来源于成体--成体干细胞
47. ES/EG细胞的鉴定方法有：细胞的形态结构、核型分析、碱性磷酸酶（AKP）染色、SSEA免疫荧光标记、OCT-4表达、分化能力检测
ES/EG细胞系的特性：无限增殖性、分化潜能性、种系传递性
简答题
1． 简述植物细胞工程的应用。
答：植物离体繁殖和脱毒、花药花粉培养及单倍体育种、原生质体的培养及体细胞杂交、次生代谢物的生产、种质资源离题保存、植物遗传转化
2． 无菌操作的注意事项有哪些？
3． 植物形态建成有哪些途径？
答：⑴器官发生途径
①器官直接发生途径：外植体à不定芽②器官间接发生途径：外植体à愈伤组织à不定芽
⑵胚状体发生途径
① 直接发生途径：外植体à体细胞胚②间接发生途径：外植体à愈伤组织à胚状体
4． 培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？
答案见作业本
5． 什么叫胚状体？体细胞胚的发生有哪些特点？
答案p52
6． 植物离体快繁定义及意义
答：①植物离体快繁是通过离体培养，将来自优良植株的茎尖、腋芽、鳞片、叶片等器官、组织或细胞进行无菌培养，经过不断切割和重复培养，使增殖并再生形成完整植株，以期在短期内以更快的速度获得遗传性均一的大量个体。
② 意义：a.快速繁殖新品种，使优良品种迅速使用
b.节约耕地，提高农产品的商品率
c．生产无病毒种苗，防止品种退化
d．便于运输
7． 离体无性快繁一般可分为那几个阶段？简述其操作的一般程序。
答案见作业本（无菌培养物的建立：健康植物上选健壮的枝梢à去叶片用自来水冲洗à 75%酒精1分钟à次氯酸钠5-10分钟à培养à再生）
8． 花药培养和花粉培养的区别是什么?
答案见作业本
9． 单倍体植株与它的二倍体相比较有什么特点？
答：a.体细胞染色体数减半
b．生长发育弱，体形小、各器官明显减小
c.雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代
10．幼胚的发育方式有哪些？
答：①胚性发育： 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。
②早熟萌发： 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。
③愈伤组织：在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。
幼胚培养的关键技术是什么？（或是注意事项）
答：a.取材时，取球形胚至鱼雷形胚阶段的胚胎
b．幼胚剥离时，要注意保湿，无菌且操作要迅速，要连胚柄一同取出
c．剥离出来的幼胚要立刻接种到培养基进行培养
11．植物体细胞杂交的意义：
答：a．实现远缘杂交，形成新的物种
b.创造细胞质杂种
c.培养作物新种质和新品种
12．在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？
答案见作业本
13．比较天然培养基和合成培养基的优缺点。
答：（1）天然培养基
• 其优点是营养成分丰富、含各种生长因子、激素，培养效果好；
• 缺点是成分复杂、来源受限，个体差异大、批次间差异大。
（2）合成培养基
优点：它能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，化学成分明确，组分稳定，同时又便于控制和标准化。这些是天然培养基无法比拟的。
缺点：不能促进细胞增殖生长；须加入胎牛血清、小牛血清等。
14．讲述原代培养和传代培养的主要的过程。
答案见作业本
15．胚胎移植的基本程序：供体和受体的选择、供体的超数排卵、受体的同期发情处理、胚胎回收、胚胎检查及质量鉴定、胚胎移植
16．ES细胞的生物学特性有哪些？
答：：①ES细胞来自正常的胚胎，具有完整的二倍体核型。②ES细胞的形态学表现为体积小、核大、胞质少、有1或2个核仁，细胞与细胞紧密地聚集在一起，细胞间界限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。③ES细胞可以表达早期胚胎细胞特异表达的基因。④ES细胞具有无限增殖的能力。⑤ES细胞具有广泛的体内分化能力。⑥ES细胞具有广泛的体外分化能力。⑦ES细胞具有种系传递功能。⑧ES细胞可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作。
论述题
简述杂交瘤生产单克隆抗体的原理及主要技术过程。
答：（1）原理
1.骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，即具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
2.HAT培养基筛选杂交瘤细胞，大量培养获取McAb
（2）过程
1、亲本细胞选择：抗原制备；免疫动物； 免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；
2、细胞融合；
3、杂交瘤细胞的选择培养；
4、特异杂交瘤细胞的筛选；
5、杂交瘤细胞的克隆化；
6、杂交瘤细胞大量培养及单克隆抗体的大量制备。
看图题

（1）细胞系的生长过程
• 原代培养期（prinmary culture）： 指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。与体内相应的细胞性状相似
• 传代期： 原代培养细胞一经传代后便称为细胞系，在生命期中该阶段持续时间最长。细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型（采取冻存）。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢以致完全停止。
• 衰退期：细胞增殖减慢直至细胞衰退。 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。
（2）一代细胞生长曲线
• 潜伏期（latent phase）:包括悬浮期及增殖迟缓期。
潜伏期长短与接种密度、细胞种类、培养基性质等
• 对数生长期（Logarithmic grouth phase）这是细胞增殖的最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。适于实验研究
细胞分裂指数（MI）表示
• 停滞期（stagnate phase）：此期细胞数量达到饱和密度后，细胞数量持平，故又称平台期。细胞增殖停止，仍有一定代谢活动。此时应传代。
• 衰亡期（senescence phase）：由于营养物质耗尽和有害物质的作用，培养细胞进入死亡的细胞，多于分裂的细胞，故叫做衰亡期。