实验D 防腐剂测定.doc

实验9（序号待统编） 紫外分光光度法测定雪碧中苯甲酸的含量
一、目的要求
1、掌握用紫外——可见分光光度法测定防腐添加剂的原理和方法
2、加深对蒸馏分离不同有机物的方法理解和操作技术的掌握
二、原理
将样品酸化后进行蒸馏，苯甲酸随蒸汽馏出。收集馏出的馏分，加入强氧化剂将馏出液中的有机物完全氧化分解，再次蒸馏，并用碱吸收得苯甲酸钠。用紫外分光光度计于225nm处进行测定。采用标准曲线法并计算样品中苯甲酸的含量。
三、仪器与试剂
紫外分光光度计，蒸馏装置。
NaOH溶液：0.1mol·L-1, 0.01mol·L-1；K2Cr2O7溶液：0.03333mol·L-1；H2SO4溶液2 mol·L-1；苯甲酸标准溶液：100mg/L，称取0.1000g苯甲酸（经105℃烘干）于250mL烧杯中，加入0.1mol·L-1NaOH100mL，搅拌溶解后，转移入1000mL容量瓶中，用水定容；Na2SO4（无水）；H3PO4。
四 实验步骤
1、标准曲线的绘制
（1）、移取50.00mL苯甲酸标准液于250mL蒸馏瓶中，加H3PO41mL，Na2SO4（无水）20g，水70mL，玻璃珠（防爆沸）3-4粒进行蒸馏。用50mL容量瓶（预先加有5mL0.1mol·L-1NaOH）收集馏出液。当馏出液约为40mL时，停止蒸馏，用少量水吹洗冷凝器，洗液并入容量瓶，最后用水定容
（2）、移取第一次馏出液于另一个250mL蒸馏瓶中，加入0.03333 mol·L-1 K2Cr2O7溶液25mL，2mol·L-1H2SO4溶液6.5mL，连接冷凝装置，在水浴上加热约10min，冷却，加入H3PO41mL，Na2SO4（无水）20g，水40mL，玻璃珠（防爆沸）3-4粒进行蒸馏。以下操作同（1）。
（3）、移取第二次馏出液2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL，分别置于50mL容量瓶中，用0.01mol·L-1 NaOH溶液定容。以0.01mol·L-1 NaOH溶液为参比，在225nm处测定吸光度，绘制工作曲线。
2.样品的测定
（1）样品溶液的制备
准确称取8-10g均匀的样品置于250mL蒸馏瓶中，以下操作按标准曲线的（1）和（2）进行。
（2）移取5-20mL试样的第二次蒸出液（按样品中苯甲酸含量的多少选择试样第二次蒸出液体积）于50mL容量瓶中，用0.01mol·L-1 NaOH溶液定容。以0.01mol·L-1 NaOH溶液为参比，在225nm处测定吸光度。
（3）空白试验：取与样品量同样的水，加入1mol·L-1NaOH5mL（不加H3PO4），以下操作同样品测定步骤测定空白试样的吸光度。
五 结果计算
苯甲酸的含量＝（C－C0）×1000/(m×25/50×V/50×1000) (g/kg)
式中：C：样品溶液中苯甲酸的含量（mg）；C0：空白溶液中苯甲酸的含量（mg）；m：样品质量(g)；V：样品溶液（第二次蒸馏液）体积（mL）。
执笔人：訾言勤

实验10（序号待统编） 可见光分光光度法测定橙汁中山梨酸的含量
一、目的要求
1、掌握用可见分光光度法测定山梨酸添加剂的原理和方法
2、加深对分光光度法测定不同有机物的方法理解和分光光度计操作技术的掌握
二 原理
山梨酸（或其盐类）在硫酸和重铬酸钾的氧化作用下，产生丙二醛，丙二醛和硫代巴比妥酸作用产生红色化合物，其最大吸收波长在530nm，在一定浓度范围内，其红色产物的吸光度与丙二醛的浓度成正比。可用分光光度法测定。
三 仪器与试剂
分光光度计（任一型号）；25mL比色管7支（10mL处有刻度）。
HCl溶液：1mol·L-1；NaOH溶液：1mol·L-1；重铬酸钾－硫酸混合溶液：0.01667mol·L-1K2Cr2O7溶液和0.15mol·L-1H2SO4溶液等体积混合；硫代巴比妥酸溶液：准确称取0.5g硫代巴比妥酸于100mL烧杯中，加入20mL水和10mL1 mol·L-1NaOH溶液，搅拌至完全溶解，再加入11mL1 mol·L-1HCl溶液，搅拌均匀，转移入100mL容量瓶中，用水定容。此溶液现配现用（若保存在冰箱中，可保存2个月）；山梨酸标准贮备液：200μg/mL，称取0.2000g 山梨酸于100　mL烧杯中，用0.1 mol·L-1NaOH溶液溶解后，转移入1000mL容量瓶中，用水定容；山梨酸标准工作液：2.00μg/mL，移取1.00mL山梨酸标准贮备液于100mL容量瓶中，用水定容。
四 标准曲线的绘制
移取山梨酸标准工作液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL分别置于6支25mL比色管中，加入水至约5mL，再加入2mL重铬酸钾－硫酸混合溶液，在100℃水浴中加热7min，立即加入1.50mL硫代巴比妥酸溶液，继续在水浴中加热10min，取出，迅速用冷水冷却，用水定容至10mL，用1cm比色皿，以试剂空白溶液为参比，于530nm处测定吸光度，绘制工作曲线。
五 样品的测定
移取2.00mL橙汁饮料于25mL比色管中，按标准曲线绘制操作步骤，测定吸光度。
六 结果计算
样品中山梨酸含量（mg/Kg）=在标准曲线上查得的微g数（μg）/2mL。
注：我国食品卫生标准规定：山梨酸及其钾盐的允许添加量为：果酱＜1g/Kg；果汁类：＜0.6g/Kg；汽水、汽酒类＜0.2g/Kg；酱油＜1g/Kg。
七 注意事项
苯甲酸的测定过程中，应根据样品中苯甲酸和有机物含量的多少适当增减第一次蒸出液体体积和重铬酸钾溶液用量。
执笔人：訾言勤

实验11（序号待统编） 酶促发酵生产1,6-二磷酸果糖表征及含量的测定

一、目的要求
1、学会发酵生产1,6-二磷酸果糖的原理；
2、掌握1,6-二磷酸果糖的分离方法；
3、掌握红外光谱法表征1,6-二磷酸果糖的方法；
4、掌握紫外可见分光光度法定量1,6-二磷酸果糖的方法。

二、实验原理
1,6-二磷酸果糖是人体代谢过程中重要的中间产物，是一种分子水平的代谢调节剂，具有激活丙酮酸激酶，加速糖酵解，增加ATP生成；加速钾离子内流，恢复细胞极化状态等生理功能，是治疗心脑血管疾病的良药。1,6-二磷酸果糖一般采用微生物发酵法生产，发酵液中1,6-二磷酸果糖的提取方法有钙、钡盐沉淀法；离子交换法；有机溶剂提取法，乙醇沉淀法等。本实验应用酵母酶系为催化转化介质，以葡萄糖糖源、磷酸盐为底物，发酵生产1，6一二磷酸果糖，发酵液中1，6一二磷酸果糖采用钙盐沉淀和有机溶剂结合提取法，研究提取FDP生产新工艺。沉淀法具有提取率高，操作简单，便于工业化生产等优点。
钙盐沉淀法提取1, 6-二磷酸果糖的工艺流程：

滤渣 弃酵母抽提物
发酵液 加热 过滤 滤液 加入氯化钙 调pH 离心分离

离心分离 沉淀 酸洗 离心分离 沉淀
滤液 滤液 调pH8.5 过滤 沉淀
FDP二钙 干燥 水洗
三 试剂与仪器
试剂：1,6-二磷酸果糖；葡萄糖；磷酸二氢钠；氯化镁；活性酵母 ；乙醇；氯化钙；氢氧化钠；盐酸；间苯二酚；硫脲；醋酸钡；蒸馏水。
仪器：1000mL试剂瓶；500mL试剂瓶3只；500mL容量瓶1只；250mL容量瓶1只；搅拌器；抽滤机；干燥机；红外光谱仪；紫外可见分光光度计。SHZ- 22型水浴恒温振荡器；CS 501型超级恒温器； WFX-110型原子吸收分光光度计。
四 实验内容和步骤
1 提取1, 6-二磷酸果糖钙
在500mL蒸馏水中加入50g葡萄糖，35g磷酸二氢钠，10g氯化镁，活性酵母 60g，调节pH为6.5，在30℃度下发酵3－5个小时。然后将发酵液加热沸腾约10min，过滤，收集滤液，并用蒸馏水将滤渣反复洗涤两遍，合并滤液。
在上面得到的滤液中加入约50mL浓度为1.0 mol·L-1的氯化钙，调节pH为8.5,不断搅拌约0.5小时，过滤，滤渣用50mL的盐酸洗涤，调溶液的pH为1.5，过滤，弃去残渣，在上层清夜中加入氢氧化钠，调节pH为8.5，过滤，弃去滤液，干燥，得1,6-二磷酸果糖钙。
2 1,6-二磷酸果糖的定性表征
为了表征1,6-二磷酸果糖二钙的结构及确定提取产品的纯度，取微量提取样品与KBr混研磨，用KBr做本底。作红外谱图。文献红外谱图如下：
1,6-二磷酸果糖二钙的红外光谱图
红外光谱测定结果表明，1,6-二磷酸果糖二钙在3417nm处有一特征峰，表明分子中存在大量的O-H基团;1646nm和1071nm处为C-O键的伸缩振动，940nm处为C-O-P的伸缩振动峰。样品红外谱图与标准谱图对照，说明提取样品性质和种类。
3. 定量条件的选择和测定
1,6-二磷酸果糖在浓盐酸中和间苯二酚反应产生紫红色的化合物，在570 nm处有特征吸收峰。取100μg／mL的1,6-二磷酸果糖溶液1 mL，分别加入浓盐酸7mL，间苯二酚1.5mg，混匀后于80℃ 水浴中加热14min；冷却后于570nm测定吸收值。
标准曲线和样品测定：1,6-二磷酸果糖标准溶液(100μg/mL )0.2 mL，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL；分别加入间苯二酚1.5mg，浓盐酸7mL，混匀后于8O℃水浴加热14 min，冷却后于570 nm测定光吸收值。绘制标准工作曲线，同样条件测定样品，计算1,6-二磷酸果糖含量。

五 数据处理
1 1,6-二磷酸果糖红外光谱法表征结果；
2 紫外可见分光光度法定量1,6-二磷酸果糖的分析结果；
六 注意事项
1 调节pH为6.5，在30℃度下发酵3－5个小时；
2 实验表明酸度对产品得率有很大的影响，酸度控制pH8.5；
3 加入乙醇可以降低溶解度；
七 思考题
1 为什么能将葡萄糖转化为1,6-二磷酸果糖？
2 如何进行1,6-二磷酸果糖的定性和定量分析？
执笔人：訾言勤